骨折愈合中诱导H型血管形成因素的研究进展*

向炜 黄山峻 曹家全 陈孝均 刘安铭 吴佳奇

骨折愈合是一个时空调控的再生过程，理想情况下骨折可完整恢复且没有纤维瘢痕形成[1]。目前，骨折的治疗已取得了巨大进展，但仍有5%～10%的骨折因为治疗不当或其他原因导致骨折延迟愈合，甚至不愈合。从骨折愈合的机制研究发现，除了软骨区域外，骨是高度血管化、代谢活跃的组织[2]，血管生成和骨生成相互耦合[3]，从而维持正常骨的形态和功能。近年来，骨科领域发现了一种可成骨并促进骨折愈合的动脉分支亚型（H 型血管），是一种高表达血小板-内皮细胞黏附分子（PECAM-1/CD31）和内皮黏蛋白的毛细血管，主要分布在骨内膜和干骺端，周围有丰富的Osterix+骨祖细胞、成骨细胞等，可以增加骨量，加速骨形成[4]。众所周知，血管再生在骨折愈合中起着关键作用，血管的形成将为骨折愈合提供充足的氧气和营养物质、分泌活跃生长因子及转运代谢产物，从而增强血管和成骨细胞间的通信，加强血管和成骨耦合[5]。骨折后的前2 周是血管生成-成骨耦合的关键窗口，在此过程中新生血管的生长对骨折愈合起了不可替代的作用。因此，在骨折愈合窗口期使用H 型血管诱导剂促进H 型血管形成，恢复骨折处血供，这将是一种促进骨折愈合的可靠的治疗新方法。本文旨在综述诱导H 型血管形成的因素并归纳其可能形成的主要机制，为骨折愈合相关研究提供一个新的视角。

1 药物因素

1.1 去铁胺（DFO）DFO 是一种低氧模拟剂，已被FAD 批准用于治疗输血铁过量疾病，其不仅可用于治疗缺血性疾病，还可作为脯氨酸羟化酶抑制剂（PHDi）和血管生成兴奋剂。在移植BMSCs 的大鼠中，使用去铁胺模拟组织缺氧环境发现，去铁胺可通过增强SDF-1/CXCR4 信号轴通路功能促进BMSCs 靶向归巢，加速BMSCs 在缺血组织中的分化，促进缺血皮瓣血管化，增加皮瓣缺血缺氧处细胞因子的表达，从而改善局部血流，减少坏死面积，有助于骨折处血管的生成及周围损伤组织的修复[6]。还发现去铁胺可以稳定HIF-1α 的表达，激活PI3K/AKT 信号通路，上调下游SDF-1、VEGF等因子的表达从而有效地促进EPCs 向损伤处迁移、靶向归巢，提高缺血组织血管化[7]。去铁胺不仅可通过促进骨内H 型血管形成改善骨密度[8]，还在牵张成骨和小鼠股骨骨折愈合过程中发现可提高骨的再生能力。在愈伤组织部位，去铁胺螯合铁触发血管生成，可以抑制HIF-1α 的脯氨酸羟基化，使HIF-1α 积累，引起核易位、二聚作用与HIF-1β，反式激活VEGF 和其他下游介质的新血管的形成，因此，注射去铁胺可以部分挽救切除卵巢小鼠受损的H 型血管[9]。在体外，去铁胺已被证明可以促进血管生成[10]，在动物模型骨折部位连续注射去铁胺时可增强骨痂新生血管生成，从而改善骨生成。去铁胺通过刺激HIF-1α 表达促H 型血管增殖，以H 型血管联合生成大量成骨转录因子Osx 为中心的高代谢成骨分化区域，可有效促进节段性骨缺损修复[11]。有研究首次发现羟基红花黄色素A（HSYA）与DFO 联合用药，上调HIF-1α 分泌，促进糖尿病大鼠创面新生血管相对细胞聚集，使伤口内形成更多的血管，从而加速创面修复[12]。因此，去铁胺促进血管成骨耦合机制可以归纳为主要通过调节HIF-1α 引起下游细胞分子的集连反应，进一步促进血管成骨耦合。回顾文献发现将DFO 与生物支架联合用于促进骨折愈合可能也是一种很好的治疗方法。最近有DFO 在人体内的首次应用报道[13]，即将可植入式血管生成/成骨刺激剂HA-DFO，用于骨折后血管生成关键时期内，将DFO 缓慢释放至骨折部位。作者主要是对一名继发于放疗后上颌发育不全的年轻患者进行治疗，发现DFO 通过上调HIF-1α 途径间接刺激血管生成从而使治疗区域的骨面积和骨密度增加，因此，可推测植入式缓慢释放去铁胺将会取得好的临床疗效，但其具体效果如何、具体注入体内时间、剂量等仍需要实验进一步研究。综合现有实验研究发现：DFO 可通过调节HIF-1α 有效促进H 型血管生成和成骨，有利于骨折后血供的建立从而促进骨折愈合，但其具体治疗的标准仍需大量实验深入研究。

1.2 雷帕霉素 雷帕霉素是一种免疫抑制剂，最早用于器官移植以减轻排斥反应，后来发现也是一种有效的自噬诱导剂，近年来在实验研究中也发现有促进血管和骨生成的作用，可能会对H 型血管的形成也有很大的促进作用。有关骨质疏松的研究表明：铁积聚可通过mTOR/STAT1/Cxcl9 通路损害骨质疏松症的骨再生，铁积聚激活mTOR，而雷帕霉素作为mTOR 抑制剂，可改善骨丢失，促进高转换型骨质疏松症的血管生成和成骨，从而增加骨量[14]。雷帕霉素可促进骨折部位血管的生成，促进成骨细胞的分化，抑制破骨细胞的分化，从而在成骨和骨保护中发挥重要作用[15]，而且还可以通过抑制mTOR活性进而增强细胞自噬活性，抑制细胞凋亡，调节骨折部位血管生成，加速骨折的有效愈合[16]。新近研究表明，在脊髓横断后，将聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）微球从施万细胞（SC）负载的带正电荷的富马酸聚乙二醇支架中持续释放雷帕霉素，可使轴突再生的能力增强并改善脊髓功能，促进新生血管的正常化[17]。但也有研究发现不同浓度的雷帕霉素对骨愈合有不同的影响：使用中、低剂量的雷帕霉素可改善血管的数量、长度和表面积[18]；如果持续或过多使用雷帕霉素将会抑制骨折愈合[19]，研究发现高剂量雷帕霉素可通过过度的抗增殖作用、自噬或抑制VEGF 的产生而损害血管形成或抗血管生成[17]，使血管数量、长度和表面积下降到未植入细胞或药物时的水平。在骨折部位血管的生成和成骨中发现，持续过多的雷帕霉素剂量将会抑制血管生成使骨折延迟愈合，甚至不愈合；适当的剂量将会促进血管生成从而加速骨折愈合。很显然，不同剂量的雷帕霉素和/或不同实验对象以及雷帕霉素的不同分子的作用机制都会对骨和血管的作用有不同的影响，因此，雷帕霉素虽然有研究表明可促进血管和成骨耦合，但其具体机制有待进一步研究。

1.3 红景天苷 藏药红景天具有活血化瘀、通脉止痛、扶正固本和补肾强身等功效。现代研究表明：红景天含有40 多种化合物，主要成分为红景天苷、酪醇等，具有抗缺氧、抗病毒、抗衰老以及神经系统的双向调节作用[20]。研究发现，红景天可以促进骨折部位血管新生以及对成骨具有保护作用，其中红景天苷（salidroside，SAL）是最重要的成分，具有上调成骨细胞骨形态发生蛋白2（BMP2）促进骨生成，在低氧和常氧条件下，SAL 对血管内皮细胞的增殖、迁移及成管都有明显的促进作用。SAL 通过调节HIF-1α 信号通路改善骨折部位血供，促进骨折部位血管和新骨的形成，并且可以很大程度改善骨的力学性能、韧性和强度，同时SAL 被证实可通过上调HIF-1α 信号通路，促进其下游靶基因VEGF 表达促进胎鼠跖骨的血管新生[21]，能直接和间接诱导ECs 的增殖、迁移和毛细血管结构的形成，并在胎鼠长骨中产生血管生成活性因子，通过HIF-1α 介导的VEGF 诱导骨组织血管生成，促进血管和骨生成的偶联[22]，并可以有效上调bFGF、VEGF 等细胞因子的表达，诱导血管新生，改善成骨细胞的供血供氧状态，促进成骨细胞的分化成熟，调节骨代谢动态平衡，最终骨化形成骨组织[23]。红景天苷作为中药红景天里的重要成分，对骨折部位血管形成具有重大的促进作用，其机制大致归纳为：一可直接上调骨形态发生蛋白2 促进成骨；二通过调节HIF-1α，使下游靶基因VEGF 等细胞因子充分表达，从而调节H 型血管形成，促进血管成骨耦合。红景天苷的临床应用有利于发挥中医药对骨折愈合的作用，但其促进H 型血管形成的具体机制有待进一步实验确认。

1.4 其他药物 在骨折局部使用氯化锰，使骨痂中细胞内和/或细胞外VEGF-A 和VEGF-C 的增加，从而增加骨折骨痂处骨膜下血管生成，促进成骨[24]。层粘连蛋白α4 链功能肽修饰脱钙骨基质支架材料可促进血管内皮祖细胞的黏附并显著促进H型血管的生成，从而在骨缺损修复中实现血管生成和骨再生的有效耦联[25]。中成药骨疏康（GSK）可通过增强HIF-1α 的表达诱导H 型血管并促进骨形成[26]。目前H 型血管形成机制不唯一，除了通过增强HIF-1α 的表达诱导H 型血管并促进成骨之外，还有通过促进PDGF-BB 分泌增加，从而促进H 型血管形成，诱导成骨。黄芪总黄酮（TFRD）在大鼠牵张成骨（DO）模型中可通过PDGFBB/PDGFR-β代替HIF-1α/VEGF 轴，加快H 型血管形成，并增强血管成骨耦合[27]。在骨质疏松小鼠模型中发现，注射肉叶芸香碱（harmine）后可抑制破骨前细胞向破骨细胞的融合，使破骨前细胞和CM 中分泌的PDGF-BB 显著增加，使小鼠骨质中PDGF-BB 浓度和H 型血管数量明显增加[28]。不同药物诱导H 型血管形成虽然有个例报道，但其研究的实验支持较少，具体的促进H 型血管形成机制不唯一，因此其诱导H 型血管促进骨折愈合的机制仍值得我们进一步研究。

2 物理因素

2.1 超声 目前，研究超声在骨愈合过程中的作用已经很普遍，尤其是低强度脉冲超声。低强度脉冲超声可以在细胞水平诱导机械力，而且已被证实可以调节血管和骨的形成[29]。从数学模型解释超声的作用发现，超声在血管生成中起关键作用，可加速血管生成，缩短骨愈合时间[30]。例如，在大鼠创伤性椎体骨折模型中发现，低强度脉冲超声可通过在时间和空间上增加软骨形成，诱导成骨细胞成骨以及促进H 型血管生成来加速创伤性椎体骨折愈合[31]；在体外和体内HADSC/HUVEC 共培养中，使用低强度脉冲超声可以增强血管生成，制备的胶原联合Col/0.5HA 支架以及低强度脉冲超声应用于干细胞与内皮细胞共培养体系中，可有效促进血管生成[32]。研究发现低强度脉冲超声处理可以激活YAP/TAZ，并将其转位到细胞核中激活靶基因，该过程可以被siYAP 灭活，被shLATS1/2 激活，通过低强度脉冲超声治疗，与Hippo 通路的交叉作用启动血管生成，从而促进骨折愈合[33]。在使用低强度脉冲超声对13 名腓骨延迟愈合患者的研究中发现，血管大小和类骨质体积之间有显著的相关性，在腓骨延迟愈合患者的骨中，低强度脉冲超声增加血管体积，使延迟愈合中类骨质体积增加，从而增加骨折部位血液供应和灌注[34]，促进血管生成和骨折愈合。超声作为一种无创、无痛苦、便捷、价廉的方法，对骨折愈合具有显著的竞争力，虽然目前已有相当多的实验研究，但其具体促进血管成骨耦合的机制有待进一步实验研究，具有深远的研究价值。

2.2 机械应力 力学环境影响骨折愈合过程中的组织血管化，机械不稳定力较稳定力更能促进早期血管生成和骨修复[35]。文献[36]表明，血管重建和骨形成依赖于碎片间运动的方向，其中循环压迫最能促进血管重建从而刺激骨愈合过程。因为循环机械载荷不仅对细胞行为（如增殖、迁移和分化）有直接影响，还对改变生化和生物物理环境有间接影响，在骨愈合早期，适度的运动会改善无血管化骨折血肿细胞或血管化不足的早期肉芽组织内的供氧，从而促进血管生成和骨折的愈合[37]。通过离体实验发现，机械牵张力能够通过调控成骨细胞促进相关血管生成因子的分泌[38]，在牵张成骨（DO）实验过程中发现，形成的骨和血管比单纯骨折愈合过程中更多，因此机械牵拉应力有利于血管生成和成骨[27]。虽然有相关文献论述机械应力能够促进骨折部位血管生成以及成骨，但其具体机制仍然有待进一步实验研究。机械应力的改变，一方面可能会刺激骨折断端与周围组织的接触，从而促进周围相关细胞因子的分泌和活跃；另一方面可能是通过机械应力的改变使周围血管收缩，加快血流速度，促进周围各种细胞因子的转运以及获得足够的营养物质，为进一步促进血管生成和成骨提供机会。

3 展望

大量研究表明H 型血管可以协调成骨细胞和破骨细胞谱系细胞之间的细胞信号传导，并产生促进骨祖细胞增殖和分化的因子，促进骨愈合。作为一种新发现的动脉分支的毛细血管亚型，H 型血管在骨折愈合中的形成将会为骨折部位提供充足的氧气、营养物质，传输成血管和成骨生长因子以及排出代谢产物，使血管生成和成骨处于动态平衡之中，从而加快骨折愈合。通过回顾文献发现：（1）目前关于H 型血管在骨折愈合中形成的研究较多，但多处于动物实验阶段，在临床实验中不多，个体差异较大，需要更加深入的进行实验研究，以便进一步验证H 型血管形成的机制，为进一步靶向治疗提供确切指导。（2）通过归纳H 型血管在骨折愈合中形成的诱导因素发现：药物中去铁胺诱导H 型血管形或成为重要因素；H 型血管形成的主要机制可能是通过调控HIF-1α，激活下级靶细胞因子相关作用，从而促进血管生成和成骨。（3）超声和机械应力均是一种无创、痛苦小、便捷、价廉的方法，适合大众人群，可行性较高，但具体机制有待进一步实验验证。

综上所述，H 型血管形成的诱导因素主要集中在药物、超声和机械应力方面，但缺乏系统的归纳，且已有相当多的综述论述H 型血管的形成机制，但促进H 型血管形成的最主要机制尚不明确，通过对H 型血管在骨折愈合中形成的诱导因素进行回顾发现：目前主要可能诱导因素为DFO；H 型血管形成的机制主要可能是HIF-1α 信号通路。本文虽然不能对所有已知的诱导因素进行全面的论述，但笔者希望通过对涉及H 型血管在骨折愈合中形成的诱导因素回顾，找到主要可能诱导因素，并找到促进H型血管在骨折愈合中形成的主要可能机制，为骨折愈合的相关研究提供一个新的视角。