血清热休克蛋白90α与甲胎蛋白异质体检测对肝细胞肝癌的诊断价值研究

杨丽萍 毛宝宏 梁勤 杨建忠 马国珍

1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的一种主要病理学类型，约占85%～90%［1］。世界范围内，HCC仍然是发生和死亡上升最快的癌症之一，也是导致癌症死亡的第三大病因［2，3］。现有的研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）和/或丙型肝炎病毒（HCV）感染、酗酒、黄曲霉毒素污染等是HCC的主要危险因素，在亚太地区，HBV感染是导致HCC的主要病因［4］。近年来，随着HCC早期诊断与治疗技术的不断发展，HCC患者生存时间有所增加，但长期预后仍然较差。有研究显示［5］，如果HCC患者能早期诊断并尽早进入临床治疗，其5年生存率将超过60%。因此，早发现、早诊断能显著降低HCC的疾病负担，改善总体生存时间。目前，临床最常用的HCC检测生物标志物为甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），但其诊断特异度不高，容易漏诊，诊断价值受限。热休克蛋白90α（heat shock protein 90a，Hsp90α）是细胞中与应激损伤关系密切的一种分子伴侣蛋白，参与PI3K-Akt等相关通路，在HCC患者血清和组织中高表达［6］，可作为HCC的诊断和预后指标。为此，本研究通过对血清Hsp90α、AFP及甲胎蛋白异质体L3（AFP-L3）联合检测，分析其对HCC的诊断价值，为提高HCC的早期诊断提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 以2020年1月至2021年8月在甘肃省中医院肝病科连续就诊的113例HCC患者及165例慢性乙型肝炎患者为研究对象。纳入的HCC患者均符合原发性肝癌规范化病理诊断标准［7］，慢性乙型肝炎患者符合最新慢性乙型肝炎防治指南中的病理学诊断标准［8］。排除标准：①合并有其他功能障碍性疾病；②转移性肝癌；③合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染；④伴有自身免疫性疾病；⑤妊娠或哺乳期女性。选取同期在我院进行体检的188例健康人群为对照组，排除各系统疾病患者，注意年龄、性别等一般特征的可比性。所有研究对象均知情同意后纳入本研究，并经院伦理委员会批准。

1.2 研究方法 清晨空腹抽取研究对象静脉血3mL，于2小时内送至检验中心，以4000r/min的转速持续离心10min，分离血清。采用罗氏公司cobas 8000全自动电化学发光系统测定血清AFP-L3及AFP水平，当检测结果大于原液检测上限时，手动稀释后重新上机测定。以酶联免疫吸附法（普罗吉生物科技有限公司）测定血清Hsp90α水平。以上所有操作均严格按照仪器说明书逐步进行，相应标准品与质控品均由仪器配套试剂公司提供。以诊断性试验的可靠性（诊断符合率）与真实性（灵敏度、特异度、约登指数），评价分析其单独或联合作用下对HCC的诊断价值，用ROC曲线比较其应用价值。

1.3 统计分析 采用SAS 9.4软件建立数据库进行统计分析，计数资料用率（%）表示，组间差异比较用χ2检验。计量资料用均数±标准差（）表示，多组间的差异比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。用O－rigin 9.2软件绘制ROC曲线评价血清Hsp90α、AFP-L3及AFP在单独或联合作用下对HCC的诊断价值。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 组间基本情况 本研究共纳入研究对象466例，其中HCC患者113例，慢性乙型肝炎患者165例，健康对照人群188例。60岁以上307例（65.88%），60岁以下159例（34.12%）；男性328例（70.39%），女性138例（29.61%）。经组间均衡性检验，三组研究对象年龄、性别、民族、文化程度及体质指数间的差异均无统计学意义（P>0.05），说明三组研究对象基线资料均衡可比。见表1。

表1 组间基本情况比较［例（%）］

2.2 组间血清肿瘤标志物水平 经方差分析，三组研究对象AFP、Hsp90α及AFP-L3差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步两两比较后结果显示，肝细胞肝癌组与慢性乙肝组的血清AFP、Hsp90α及AFP-L3的水平均高于健康对照组（P<0.05）。见表2。

表2 组间血清肿瘤标志物差异情况（）

表2 组间血清肿瘤标志物差异情况（）

注：a：肝细胞肝癌组与健康对照组两两比较P<0.05；b：慢性肝炎组与健康对照组两两比较P<0.05

血清肿瘤标志物 肝细胞肝癌组（n=113） 慢性乙肝组（n=165） 健康对照组（n=188） F P Hsp90α（ng/mL） 139.46±46.82a 73.41±16.40b 50.19±13.86 407.98 <0.001 AFP-L3（%） 27.49±11.58a 5.38±2.80b 2.34±1.09 686.12 <0.001 AFP（ng/mL） 247.48±119.13a 55.15±31.04b 11.23±4.40 549.013 <0.001

2.3 各肿瘤标志物单独或联合检测对HCC的诊断价值分析 单一指标检测诊断HCC时，AFP-L3的诊断符合率最高（85.16%），其约登指数也最大（0.687）。进一步联合诊断分析显示，当Hsp90α、AFP-L3及AFP检测均阳性（串联试验）时，诊断肝细胞肝癌的灵敏度、特异度、诊断符合率、约登指数等均最大，分别为91.29%、93.42%、93.72%、0.847，提示三种血清标志物串联试验时，对肝细胞肝癌的诊断价值最高。见表3。

2.4 血清肿瘤标志物单独或联合检测ROC曲线下面积比较Hsp90α、AFP-L3及AFP诊断HCC的ROC曲线分析显示，三种血清标志物联合检测诊断HCC的曲线下面积最大（AUC=0.945），高于各指标单独或联合检测的曲线下面积，见表3与图1。经假设检验，与AFP曲线下面积相比（AUC=0.812），Z=5.205，P<0.001；与Hsp90α曲线下面积相比（AUC=0.806），Z=5.093，P<0.001，均具有统计学差异。与AFP+Hsp90α曲线下面积相比（AUC＝0.921），Z＝1.357，P＝0.087，差异无统计学意义，说明三种指标联合检测的诊断价值更高，但AFP+Hsp90α联合诊断与AFP+Hsp90α+AFP-L3联合诊断的效能差异无统计学意义。

图1 Hsp90α、AFP-L3及AFP联合检测诊断HCC的ROC曲线图

表3 Hsp90α、AFP-L3与AFP对HCC的诊断价值分析

3 讨论

据统计，全球约有20亿人感染HBV，其中有2.6亿人目前仍处于持续感染状态，每年由HBV感染引起的肝硬化和肝癌患者达88.7万人，其中与HBV感染相关的癌变占19.20%［9，10］。作为全球范围内发病率最高的癌症之一，肝癌已成为继肺癌和结直肠癌之后的世界第三大癌症死亡原因［11］，而这其中绝大多数为HCC。由于缺乏早期症状和体征，大多数HCC患者在临床上被发现时已是侵袭性肿瘤进展阶段，严重影响了患者的预后。因此，发现一组特异性高、可靠性强的HCC早期诊断标志物已成为当下一个紧迫任务。

AFP是目前HCC辅助性诊断中常用的血清标志物，它会随着肝细胞的再生而升高，在部分肝硬化及肝脏炎症患者中也会出现不同程度的升高［12］，降低了AFP作为肿瘤标志物的特异性。近年来，随着人们对AFP糖基化形式的不断研究，发现血清中不同AFP糖基化特征不仅反映其数量的改变，而且能定性评估原发性肝癌表达的蛋白质［13］。美国FDA已将甲胎蛋白异质体比率（AFP-L3%）作为高特异性指标纳入原发性肝癌的预警标志，并将AFP-L3%≥10%作为诊断原发性肝癌的临界值。Hsp 90α是一种分子伴侣蛋白，广泛参与转录调控、信号转导等生理活动，在多种恶性肿瘤中均有异常表达。正常静止的细胞不分泌Hsp90α［14］，但在辐射、缺氧等细胞环境改变的情况下，Hsp90α可分泌到细胞外，与Hsp70、转化生长因子α（TGF-α）等组织损伤释放的细胞因子共同影响肿瘤实体的微血管浸润、侵袭、生长及转移，这一过程很可能在肝细胞癌变的初期或前期就已启动［6，14］。也有研究证实，使用Hsp90α抑制剂可显著减少Hsp90α的过表达，阻止肝肿瘤细胞的增殖与分裂［15］。由此表明，Hsp90α不仅可作为HCC的早期诊断标志物，还可为其靶向治疗提供理论支持。

本研究显示，HCC患者血清Hsp90α与AFP-L3水平均高于慢性乙肝患者及健康人群。进一步分析发现，单一指标诊断HCC时，AFP的灵敏度最低（72.26%），Hsp90α最高（80.25%），而AFP-L3的特异度较好（90.46%）且约登指数最大，这与国内外相关研究结果类似［16］，提示血清AFP-L3能很好区分肝脏的良恶性病变，而Hsp90α在HCC患者血清和组织中表达较高。三种指标联合诊断时，其灵敏度、特异度、约登指数均最大，经ROC曲线下面积比较具有统计学意义，说明联合检测能规避单一指标的检测缺点，使灵敏度和特异度具有良好的互补作用，减少了HCC的误诊和漏诊，显著提升了诊断符合率，具有较好的临床应用价值。

HCC的早期筛查与诊断具有重要的临床意义，能较早选择理想的治疗方案，提高患者的生活质量，减轻了患者的疾病负担。近年来，随着转录组学、蛋白质组学及代谢组学研究的不断深入，使HCC的早期筛查与诊断逐渐成为可能。目前已报道能用于早期诊断HCC的血清标志物较多，但还没有发现较为理想的组合筛查形式［17］。本研究结果表明，血清Hsp90α、AFP-L3及AFP联合检测可显著提升HCC的诊断符合率，弥补单一检测指标的不足，提高了HCC的早期诊断价值，具有临床应用价值。