替莫唑胺在恶性胶质瘤治疗方面的研究进展

高 行 王 滨 孙绍伟 张 恒 姚洪杰 边瑞民

滨州医学院附属医院药学部，山东滨州 256600

脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，其发病率占全部颅内肿瘤的40%[1]。目前脑胶质瘤治疗的总原则仍然是手术、放疗和化疗，但由于其浸润性生长的生物学特点，使上述治疗手段均难以达到满意疗效，患者中位生存时间只有12个月[2]，且骨髓抑制、消化道反应等不良反应多发。胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是胶质瘤中最常见、最恶性的亚型，被世界卫生组织分级系统列为Ⅳ级[3]（Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤被定义为高等级胶质瘤或恶性胶质瘤）。尽管神经外科技术不断创新，新的抗癌药物和分子靶向药物不断发展，放射治疗在过去几十年取得了诸多进展，但恶性胶质瘤，尤其是GBM，仍然是致命的疾病。虽然恶性胶质瘤患者已经接受PCV-3（丙卡巴嗪、洛莫司汀、长春新碱）等放疗和化疗联合治疗的方案[4]，但与单纯放疗相比，其他方案未能显著提高患者中位生存率。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是目前临床上唯一可以用于提高高等级胶质瘤患者生存率的药物，TMZ是一种口服烷化剂，通过鸟嘌呤O6烷基化，干扰DNA的复制，最终导致细胞凋亡[5]。TMZ是一种较新的烷基化药物，在恶性胶质瘤和恶性黑色素瘤的治疗中受到广泛关注。TMZ耐受性好，可口服，易透过血脑屏障[6]。而TMZ一个关键的耐药机制是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）的过表达[7]，O6- 苄基鸟嘌呤（O6-BG）通过调节恶性胶质瘤异种移植瘤模型中MGMT的表达来逆转TMZ的治疗耐药，但这种治疗通常与血液毒性有关。基因治疗是治疗恶性肿瘤有效方法的一种，与传统疗法不同的是，其可根据对疾病的了解来设计和定制专门的疗法[8]。近年来，一些动物模型研究表明，通过基因治疗可降低MGMT水平，克服TMZ耐药性，促进肿瘤细胞凋亡[9]。本研究概述了该领域的最新进展，并对TMZ在恶性胶质瘤治疗的作用机理和化学抗性加以综述，以期为TMZ的临床应用提供理论依据。

1 TMZ的抗癌机制

TMZ是米托唑胺的一种类似物，在Ⅰ期研究中米托唑胺出现严重的骨髓压迫，而其3-甲基衍生物TMZ在小鼠肿瘤实验中表现出了较低的毒性作用和广谱活性。同时Ⅰ期试验还显示TMZ对黑色素瘤患者和复发恶性胶质瘤患者的耐受性和反应性良好[10]。

口服TMZ生物利用度可达100%，TMZ在体内可转化为5-（3-甲基三氮酮）咪唑-4-碳酰亚胺[5-（3-methyl triazone）imidazole-4-carbonamide，MTIC]，MTIC可分解为甲基重氮离子和5-氨基咪唑 -4-羧酰胺（5-aminoimidazole-4-carboxamide，AIC），AIC通过肾脏排出，甲基重氮阳离子将甲基传递到DNA，这些甲基被转移到鸟嘌呤的第6位氧原子上，形成了O6-甲基鸟嘌呤[11]。在DNA复制过程中，O6-甲基鸟嘌呤与胸腺嘧啶不是细胞嘧啶错误配对，胸腺嘧啶错配可以通过复制后错配修复系统进行识别，该系统在修复胸腺嘧啶的同时去除其中一个子链，使O6-甲基鸟嘌呤在间隙填充时再次与胸腺嘧啶配对[12]。如果间隙结构发生复制，就会形成双链断裂。由于这种细胞毒性依赖于复制，因此包括TMZ在内的甲基化剂对恶化程度较高的肿瘤细胞的作用比恶化程度相对较低的肿瘤细胞的作用更为有效。

2 DNA修复MGMT

MGMT是一种DNA修复蛋白，可反转鸟嘌呤O6位的烷基化，以补偿烷基化剂的作用。MGMT的表达会因种类、器官、肿瘤种类和细胞系的不同而不同。20世纪90年代初，Mer-细胞株（MGMT低表达细胞株）被研制，揭示了DNA甲基化与MGMT表达之间的相关性。由于MGMT基因的缺失、突变、重排和mRNA失稳是罕见事件，欧洲癌症研究和治疗组织（EORTC）和加拿大国家癌症研究所的研究报告中显示MGMT启动子甲基化在GBM患者的发生率是45%[13]。提示含有甲基化MGMT启动子的GBM患者在TMZ治疗后，病情得到明显缓解。除了可调节TMZ敏感性，甲基化介导的MGMT沉默在GBM细胞生物学中具有重要意义，因为它可能导致另一种参与肿瘤进展的基因突变，如TP53和K-ras[14]。

3 TMZ在胶质瘤中的应用

TMZ化疗是胶质瘤综合治疗中的重要环节，胶质瘤对TMZ产生耐药性是导致远期治疗效果不佳的关键原因，胶质瘤TMZ耐药的产生是多因素、多机制共同参与的过程，其涉及的分子种类繁多，调控机制复杂。目前认为胶质瘤TMZ耐药的可能分子机制主要有[15]：①DNA损伤修复，如同源染色体重组修复，MGMT直接修复；②多药耐药相关蛋白异常高表达；③细胞凋亡通路改变；④肿瘤干细胞介导；⑤肿瘤免疫微环境改变，如保护性自噬、非折叠蛋白反应增加等。

4 TMZ的临床研究以及化学抗性研究

临床抗肿瘤药物主要通过破坏肿瘤细胞的DNA结构，诱导DNA损伤，诱发细胞凋亡或程序性坏死而发挥作用。但是，当出现DNA损伤时，细胞往往通过各种途径来修复损伤的DNA，进而阻止细胞发生凋亡。TMZ作为胶质瘤临床治疗一线化疗药物，主要通过活化为MTIC并迅速生成AIC，引发甲基转移，致使DNA烷化剂受损，然而，胶质瘤细胞内的DNA修复酶很大程度降低了TMZ的化疗疗效，因此，TMZ的化学抗性也是临床应用的另一挑战。

卡莫司汀（BCNU）植入膜剂是一种与BCNU结合的高分子植入物，用于术中局部将BCNU输送到切除表面。GBM的表皮生长因子受体（EGFR）扩增34%，EGFR的突变或扩增在GBM的进展中起重要作用[16]。厄洛替尼是酪氨酸激酶抑制剂，选择性抑制EGFR，虽然在使用TMZ治疗中未发生不良事件，但在总生存率中也未发现明显的获益，厄洛替尼对未选择的GBM病例影响不足；伊马替尼也是一种酪氨酸激酶抑制剂，仅对亚群患者有较好的疗效[17]；贝伐单抗也是一种酪氨酸激酶抑制剂，选择性地抑制血管内皮生长因子。一项小规模研究显示贝伐单抗联合TMZ和放疗对GBM有较好的疗效[18]。虽然沙利度胺和塞来昔布也被认为对肿瘤有抗血管生成的作用，但未观察到对肿瘤存活的有益作用。

5 TMZ化学抗性机制

骨髓抑制是TMZ最为严重的剂量性不良反应，但对于TMZ引起的骨髓抑制的治疗相对容易。出现3级或4级血小板减少症占6%～10%，3级或4级中性粒细胞减少症、白细胞减少症或贫血患者各占不到5%。Yung等[19]的研究中发现一系列其他的3级或4级副作用，最常见的是虚弱（6%）、头痛（6%）、恶心（10%）和呕吐（6%）。在临床用药过程中，TMZ和丙卡嗪的骨髓抑制作用相似，但恶心、呕吐和疲劳在丙卡嗪组更为常见。其中出现不良反应的数量受给药周期和治疗时间的影响。在对TMZ骨髓抑制不良反应的研究中，p53为一重要研究靶点。

p53是一种多效分子，在DNA修复和细胞凋亡中起重要作用，其机制与MGMT不同。p53可以抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡和细胞衰老。p53还可调控大分子代谢中编码多种酶的基因转录[20]。最近的数据显示，用抑制剂或siRNA抑制p53可以引起对O6-甲基化剂的耐药性，这一现象可以用MGMT抑制来解释[21]。Harris等[22]研究表明，携带p53的腺病毒载体可下调IMR人成纤维细胞中DNA修复基因MGMT的表达。相反，在另一篇报道中，p53可直接诱导小鼠星形胶质细胞瘤细胞MGMT 表达[23]。

6 基因抑制MGMT改善TMZ化学抗性

人干扰素β（interferon-β，IFN-β）是Ⅰ型干扰素家族的一员。近期研究表明，IFN-β可增强TMZ等化疗药物的细胞毒性，TMZ与IFN-β在临床上相关浓度的TMZ耐药胶质瘤细胞中具有协同作用，可能是通过减弱MGMT表达起作用[24]。黑色素瘤分化相关基因-7（melanoma differentiation genes-7，mda-7）首次被确认为是与转移性人类黑色素瘤细胞终末分化相关的基因[25]。根据mda-7的生化特性，将其归为白介素（interleukin，IL）-10细胞因子家族的一员，IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-26，现称IL-24。IL-24具有强大的抗肿瘤、抗血管生成和细胞因子活性。表达IL-24的复制缺陷腺病毒通过抑制MGMT蛋白表达使耐药黑色素瘤细胞对TMZ敏感。针对IL-24或其受体的中和抗体阻断了IL-24联合MGMT治疗的凋亡活性，说明IL-24的表达是逆转黑色素瘤细胞TMZ耐药的必要条件。这些结果表明IL-24可能是肿瘤细胞对TMZ增敏的良好候选药物。

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是在秀丽隐杆线虫中首次发现的转录后基因沉默现象。RNAi具有特异性，可高效下调靶基因，其已被评价为对人类癌症的一种潜在治疗策略。Natsume等[26]的研究表明，将含有MGMT-siRNA的脂质体转到TMZ耐药胶质瘤细胞中，可以增强其对TMZ的敏感性。

7 小结

综上所述，虽然新型烷基化剂TMZ可改善GBM患者预后，对恶性胶质瘤的治疗有影响，但GBM仍是一种难以治愈的疾病，DNA修复蛋白MGMT在细胞对TMZ的抗性中起着重要作用。低水平的MGMT与治疗成功相关，而高水平的MGMT与治疗失败相关。而TMZ的治疗方式仍然需要突破，诸多问题有待明确，其中较为重要的一点是其耐药机制，其分子作用靶点主要包括MGMT、错配修复酶、DNA切除修复酶、PARP、p53、ABC超家族、凋亡相关因子等，若能针对这些靶点给予相应的干预以及辅助治疗，不但能够提高患者对TMZ敏感性，而且对深入了解TMZ的潜在化学抗性及干细胞表型在GBM的临床治疗同样具有重要意义。