脏层胸膜侵犯在非小细胞肺癌中诊断与预后的研究进展*

李炫呈 黄云超 赵光强 孙卓琛 所元东 李首卓 宁雄

世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）2020 年发布的全球癌症统计报告中指出，2020 年中国肺癌发病人数达82 万例，死亡人数达71 万例，均位列我国恶性肿瘤首位[1]。脏层胸膜侵犯（VPI）是影响非小细胞肺癌（NSCLC）预后的重要不良因素之一[2-3]。VPI 的准确诊断与预测，对于治疗方式的选择及预后评估尤为重要。

1 脏层胸膜解剖及对肿瘤分级分期的影响

覆盖在肺表面的胸膜是脏层胸膜，脏层胸膜与肺实质紧密结合不可分离，并且弯折入肺裂内，形成不可分离的整体。在之前的解剖生理中认为在弹性纤维染色的帮助下，制片质量较高的切片可以在显微镜下观察到胸膜的5 层结构[4]。有研究表明，这5 层结构中包括显色明显的外弹力层及宽度不均的内弹力层，且内外弹力层存在相互融合的情况[5]。因此两层存在的融合情况使得通常可以在显微镜下观察到4 层组织学结构，即：（1）位于基底膜上的单层间皮细胞，称为间皮层；（2）间皮下结缔组织层；（3）根据内、外弹力层的融合或分隔，可表现为一层或者两层结构的弹力纤维层；（4）将肺实质和弹力纤维层分隔，厚度不均的结缔组织层[6]。

VPI 定义为肿瘤突破到脏层胸膜弹性纤维层及以外组织，无论其是否暴露于胸膜表面。由于弹力层的结构存在变异，此处的弹力层概指内弹力层、外弹力层及两者间的组织[7]。2009 年国际肺癌研究协 会（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）第7 版肺癌TNM 分期中提出了改进的Hammar 分级标准，将肺癌胸膜侵犯分为四类：PL0 为肿瘤未突破脏层胸膜或侵入脏层胸膜表面但未超过脏层胸膜的弹力纤维层；PL1 指肿瘤突破脏层胸膜弹力纤维层但未达到胸膜表面；PL2 指肿瘤超过脏层胸膜弹力纤维层且侵犯胸膜表面；PL3 指肿瘤侵犯壁层胸膜及其相邻结构，PL1 和PL2 被归为VPI 阳性组，而PL0 被归为VPI 阴性组[5，8]。2017 年发布的第8 版TNM 分期中指出，VPI 的判定依据肿瘤是否累及弹性纤维层，主要适用于病理分期。因而以此标准诊断VPI 时，应将内弹力层、外弹力层及两者间的组织视为一体。这一定义及分级基本沿用了第7 版TNM 分期的内容，研究重点转向到肿瘤大小细分对分期及预后的影响。第8 版肺癌TNM 分期标准明确指出：早期NSCLC 侵犯脏层胸膜时，不论结节是否≤3 cm，T 分期都应从T1提升至T2a。这也使得TNM 分期应从ⅠA 期（T1N0M0）提升至ⅠB 期（T2aN0M0）[9]。因VPI 产生的升期对于临床治疗方案的选择是存在显著影响的，最新版的2020 中国临床肿瘤学会非小细胞肺癌指南中提到，不建议对ⅠA 期非小细胞肺癌进行辅助化疗，而ⅠB 期非小细胞肺癌（包括有高危因素的肺癌），临床上需要根据个体情况选择术后的后续治疗[10]。

2 弹力纤维染色在VPI诊断中的作用

弹力纤维层是脏层胸膜中受到最多关注的解剖结构，1988 年国际上提出肺癌胸膜侵犯分级的同时，也为肿瘤突破脏层胸膜弹力纤维层即是肿瘤侵犯脏层胸膜这一观点提供了依据。Liang 等[11]一项1 055 例的病例研究也证实了弹力纤维染色在测定VPI 方面效果显著，因此弹力纤维染色应该被推荐作为评估VPI 的标准方法。目前VPI 的评估以病理学诊断为主，弹力纤维是肺支气管及肺泡的支撑结构，具有维持正常肺泡解剖学结构和生理学功能的作用。当肺部出现病变，如恶性肿瘤时，弹力纤维会出现一定程度上的病变，如增生、断裂等[12]。常规HE 染色下，病理医师通过判断弹力纤维组织结构的变化情况及肿瘤细胞与弹力纤维层之间的位置关系，可以明确肺癌是否发生胸膜侵犯。但在实际操作中病灶中细胞成分的差异及弹力纤维不可预测的变化会使得这种判断存在误差风险。因此在HE 染色下难以评估的情况下，弹力纤维染色的应用可以较为有效地观察到肿瘤细胞是否侵犯或者突破弹力纤维层。这种染色方法也受到了IASLC 第8 版肺癌TNM分期的推荐。目前常用的弹力纤维染色法主要包括以下几种：Weigert 间苯二酚-品红法、Schmorl 弹力纤维染色法、Gomori 醛复红染色法、Verhoeff-VanGieson 弹力纤维染色法、维多利亚蓝弹力纤维染色法等[13]。弹力纤维染色可以将弹力纤维染成蓝绿色，但难以明确肿瘤是否侵犯或突破弹力纤维层。角蛋白免疫组化染色可以显示可疑的肿瘤细胞，但无法指明其与弹力纤维层之间的位置关系。近年来，角蛋白免疫组化联合弹力纤维染色的双重染色方法得到了关注。孔洁等[14]使用免疫组化角蛋白联合弹力纤维双重染色的方法，使上皮细胞和弹力纤维同时染色，明确显示肿瘤与脏层胸膜弹力纤维层之间的位置关系。王敏等[13]的研究表明，使用双重染色识别阳性率更高，同时可以判断更早期的胸膜侵犯。Wang 等[15]通过比较细胞角蛋白AE1/AE3 的免疫组织化学染色联合维多利亚蓝，GAF 或Weigert 的间苯二酚-紫红色（WRF）的双重染色方法，发现维多利亚蓝和全细胞角蛋白免疫染色准确度最高。他们建议在VPI 难以评估时联合使用维多利亚蓝和全细胞角蛋白免疫染色。丁闻洁等[16]提出了弹力纤维染色联合双重免疫组化染色方式诊断胸膜侵犯的方法并在临床获得了一定的成果。目前临床上染色方法的选择并无定论，更多取决于实验室的标准及操作者的临床习惯和经验，期待双重染色的广泛应用能够推进染色方法标准化的进程。

3 VPI对NSCLC预后的影响

随着弹力纤维染色的应用及TNM 分期的不断完善，目前已有多项研究证明VPI 是NSCLC 预后的危险因素[17-18]。Jiang 等[2]进行的一项涉及27 000 例淋巴结阴性患者的meta 分析，通过肿瘤大小分组，对伴或不伴VPI 的患者进行了为期5年的生存数据分析，证明了VPI 降低了相关患者的总生存期。Adachi等[18]回顾性分析了2005-2007 年在横滨胸外科联盟附属九家医院接受完全切除术的639 例NSCLC 患者的临床病理学特征和结局，证实了VPI 的存在即会导致患者预后恶化这一结论。Manac’h 等[17]对1984-1996 年1 281 例接受根治性肺癌切除的非小细胞肺癌患者的临床资料进行预后分析，证明了胸膜侵犯是患者预后不良的重要因素，并且侧面印证了脱落肿瘤细胞经纵隔淋巴通路进入胸膜淋巴管引流这一假说。除以上研究以外，Shimizu 等[19]、Shin等[20]、Maeda 等[21]也持相同的看法。

目前VPI 的研究多聚焦在VPI 与肿瘤大小的关系、胸膜侵犯分级、淋巴结转移对预后的影响这几方面上。第8 版TNM 分期系统将肿瘤按照大小进行T 分期，VPI 对预后的影响也多以此为组别进行分析。肿瘤≤3 cm 的研究中，Kawase 等[22]回顾性分析了日本肺癌联合委员会登记的4 995 例患者的临床病理特征和预后，得到结论如下：伴有VPI 的T1a的预后明显差于无VPI 的T1a，但有VPI 的T1b与无VPI 的T2a、有VPI 的T1b与无VPI 的T2b的生存率无显著差异。即有VPI 的T1b与无VPI 的T2a/T2b预后相似。有VPI 的T1a的预后明显差于无VPI的T1a，但有VPI 的T1a与无VPI 的T1b、有VPI 的T1a与无VPI 的T2a的生存率无显著差异。有VPI 的T1a预后与无VPI 的T1b/T2a相似。这也侧面呼应了第7 版TNM 分期中伴有VPI 的T1期肿瘤升期的改动。Luo 等[23]进行的一项基于3 项随机临床试验和9 项回顾性研究的meta 分析指出，肿瘤组织较小的患者，通过病理学检查辨别是否存在胸膜转移尤为关键。陈天羽等[24]认为在肿瘤最大径≤3 cm 的肺腺癌中，VPI 与患者预后影响存在显著的联系。然而，Tian 等[25]认为肿瘤≤2 cm 的病例预后不受VPI的影响，但在肿瘤为2～3 cm 的淋巴结阴性的完全切除术的患者中，VPI 确为不良预后因素。Nitadori等[26]的研究也印证了这一观点。Huang 等[27]的一项关于Ⅰ期非小细胞肺癌内脏胸膜侵袭预后意义的meta 分析提示，VPI 是Ⅰ期非小细胞肺癌患者的一个与大小相互独立的不良预后因素。Chen 等[28]、Heidinger 等[29]也支持这一观点。总之，目前多数研究确定VPI 即为影响非小细胞肺癌预后的重要不良因素，但在肿瘤大小对于预后的影响上趋于细化，这仍需相关研究和设计进一步证实。

在3～5 cm 的肿瘤分析中，Kawase 等[22]研究显示，有VPI 的T2a预后明显差于无VPI 的T2a。有VPI 的T2a和无VPI 的T2b之间的生存率无显著差异。T2a合并VPI 的预后明显优于T3。综上所述，有VPI的T2a与无VPI 的T2b预后相似，提示有VPI 的T2a应升级为T2b。Qi 等[30]的一项基于SEER 数据库的4 005 例3.1～5.0 cm 的pT2N0M0期的NSCLC 患者数据的回顾性分析指出，VPI 阳性的pT2aN0M0期NSCLC 患者与VPI 阴性的pT2bN0M0期NSCLC 患者相比，总生存率无显著差异，且VPI 与年龄、性别、分化等级和肿瘤大小明显相关。Jiang 等[2]进行的meta 分析显示，伴有VPI 的肿瘤≤3 cm 的患者5 年生存期明显优于肿瘤大小为3～5 cm 伴有VPI 的患者，但与肿瘤大小为3～5 cm 不伴有VPI 的患者生存期无明显差异。然而Yanagawa 等[31]的一项433 例Ⅰ期非小细胞肺癌术后患者预后的回顾性分析表明，在多因素分析中VPI 并不是独立的预后危险因素。Tian等[25]的研究证实肿瘤大小为3～5 cm 或5～7 cm 的病例的预后不受VPI 的显著影响。Yang 等[32]一项基于SEER 数据库9 901 例接受肺部切除术患者数据的倾向评分匹配研究表明，伴有VPI 的肿瘤1～3 cm的患者存活率显著降低，而在肿瘤≤1 cm、3～5 cm的组别里无明显差异。Adachi 等[18]的研究也显示了肿瘤大小超过3 cm 的患者，VPI 存在与否，对生存率没有显著影响。

在5～7 cm 的肿瘤分析中，多数研究认为此大小规模的肿瘤伴有VPI 时，应提升其T 分期。Shim等[33]、Yoshida 等[34]认为T2b期的肿瘤若确认VPI存在，则分期应提升至T3。David 等[35]进行了一项基于1 166 例pN0M0期行肺叶切除术的NSCLC 患者的回顾性分析，研究表示VPI 与肿瘤直径超过5 cm的患者预后呈负相关。同时也有部分研究存在不同的意见。Kawase 等[22]的研究就显示VPI 阳性的T2a和VPI 阴性的T2b之间，VPI 阳性的T2b和VPI 阴性的T2b之间无显著的生存差异。Tian 等[25]的研究支持5～7 cm 的病例的预后不受VPI 影响这一观点。

于此之外，一部分专注于VPI 的程度对于预后影响的研究也出现了两种不同的结论。一方面研究结果认为VPI 与生存率显著降低相关，但PL1 和PL2 之间无生存差异。Shimizu 等[36]在一项超过1 600 例患者的分析中发现PL1 和PL2 之间生存率无显著差异。Kawase 等[37]还报道了一项在2 700 多例使用弹性染色评估VPI 的患者队列研究中，PL1和PL2 之间无生存差异。Adachi 等[18]在一项包含639 例患者的研究中发现VPI 的具体程度对术后生存没有影响。Wo 等[38]的研究结果也支持这一观点。换言之，VPI 是否存在对术后生存的影响远远大于VPI 侵犯深度对术后生存的影响。相比之下，Hung等[39]认为PL2 是淋巴结阴性NSCLC 中生存率较差和频繁复发的观测指标。Wang 等[15]进行的一项meta 分析也证实了PL1 患者的生存率优于PL2 患者。陈天羽等[24]认为在肿瘤最大径≤3 cm 的肺腺癌中，VPI 与预后不良显著相关，但只有PL2 是患者PFS 的独立预测因素。Liang 等[11]近期进行的一项基于1 055 例患者的研究表明，只考虑淋巴结阴性病例时，PL1 组的生存率明显优于PL2 组。

在以上研究方向之外，VPI 与非小细胞肺癌病理学类型及肿瘤分子特征是否存在联系也受到了一定的关注。Le 等[40]认为EGFR 信号通路可能通过其下游效应基因miR-135b 促进VPI 的发展。Lin等[41]在172 例肿瘤不超过2 cm 的患者临床资料中观察到EGFR 突变与VPI 之间无明显关联。Shi等[42]从508 例手术切除的Ⅰ～Ⅲ期NSCLC 患者中采集临床病理特征和随访信息，分析发现EGFR突变与NSCLC 的VPI 发展显著相关。Heidinger等[29]2019 年进行的一项286 例和切除胸膜表面直接接触的腺癌患者的回顾性研究发现，实性结节中VPI 的发生频率明显高于亚实性结节，这也侧面印证了组织学上关于表现为实性结节的肺腺癌较亚实性结节肺腺癌更具侵袭性这一事实。Zhang 等[43]研究发现伴有VPI 的肺癌较不伴VPI 的分化更差，Lakha 等[44]发现与无VPI 的患者相比，患有VPI的患者更有可能出现腺癌。Deng 等[45]在一项包括403 例肿瘤大小≤3 cm 的NSCLC 手术患者的临床和病理特征的回顾性分析中证明，VPI 阳性组中腺癌的比例往往高于VPI 阴性组，病理类型与早期NSCLC 中的VPI 显著相关，伴有VPI 的非小细胞肺癌比不伴有VPI 的NSCLC 更容易发生淋巴结转移。

目前关于VPI 与组织学类型、肿瘤侵袭性、分子特征、淋巴结转移等之间的联系影响的研究并未受到广泛关注，这些研究方向的深入应该可以成为下一步了解研究VPI 的关键点。目前的研究主要建立于病理学上对于VPI 的诊断，虽然目前弹力纤维染色已成为诊断VPI 的主要染色方法，但是并未有权威的执行标准及共识性的染色方法选择的确定，这可能会引起诊断的误差及对研究结果的影响。