汉黄芩素对肺炎支原体肺炎小鼠肺组织中肺上皮间质形成因子表达的影响

王斯楚，孙 一，王晓溪，王 欣，蒙艳丽，王伟明

汉黄芩素对肺炎支原体肺炎小鼠肺组织中肺上皮间质形成因子表达的影响

王斯楚，孙 一，王晓溪，王 欣，蒙艳丽*，王伟明*

黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036

探讨汉黄芩素通过调控肺上皮间质形成因子的表达，治疗肺炎支原体肺炎的作用机制。运用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）技术检测芩百清肺浓缩丸中的活性成分汉黄芩素，通过Biacore垂钓技术将其与转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）进行结合，动力学分析验证其结合的特异性。采用Tripos Sybyl-X2.1.1以及Discovery Studio2016软件对汉黄芩素和TGF-β1进行分子对接，对药物分子与受体蛋白的结合模式进行可视化分析。通过动物实验制作小鼠肺部病理组织切片，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、Masson染色，观察其病理结构形态。运用实时（real-time，RT）-PCR、免疫组化（immunohistochemistry）技术检测汉黄芩素对小鼠肺组织中TGF-β1、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、波形蛋白、E-钙黏蛋白mRNA和蛋白的表达水平的影响。Biacore垂钓得到的样品经UPLC-Q-TOF-MS鉴定分析为汉黄芩素。汉黄芩素与TGF-β1存在较强的特异性结合。HE染色和Masson染色结果表明，汉黄芩素给药组小鼠肺组织形态结构与对照组相似。免疫组化实验结果表明，与模型组相比，汉黄芩素中、高剂量组TGF-β1、波形蛋白的表达均明显减少（＜0.05、0.01），EGF、E-钙黏蛋白的表达升高（＜0.05、0.01）。RT-PCR实验结果表明，与模型组相比，汉黄芩素各给药组小鼠肺组织波形蛋白的mRNA表达水平显著降低（＜0.05、0.001），和E-钙黏蛋白的mRNA表达显著升高（＜0.05）。汉黄芩素能够下调TGF-β1和波形蛋白的表达，同时上调EGF和E-钙黏蛋白的表达，从而达到治疗肺炎支原体肺炎及肺组织纤维化的目的。

肺炎支原体；汉黄芩素；上皮间质转化；表皮生长因子；E-钙黏蛋白；转化生长因子β1；波形蛋白

肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是一种常见的社会获得性肺炎，其主要发病机制为肺炎支原体经飞沫传播，进入呼吸道后黏附于气道上皮细胞，导致上皮细胞破坏、死亡[1]，多发于学龄前和学龄期儿童，约占肺炎总数的30%，加之儿童免疫力低下可诱发混合感染，具有延绵不愈、易复发的特点，严重影响生活质量[2]。MPP属于间质性肺炎，以肺间质纤维素沉积为主要病理改变，有时并发支气管肺炎，X线可出现两肺中、下野弥散性网状或结节状阴影[3]。有研究表明，肺炎支原体反复感染肺部可导致肺间质纤维素沉积[4]，肺纤维细胞除了来源于肺内固有的间充质细胞外，还能由支气管肺泡上皮细胞通过上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而来，且在炎症反应持续的情况下，EMT的过程也会持续存在，最终造成组织器官纤维化病变[5]。目前的临床用药常选用阿奇霉素等大环内酯类抗生素，但对于肺炎支原体反复发作慢性迁延导致纤维素沉积，其不具有预防和治疗作用。且随着抗生素的广泛长期使用，患者会产生耐药性，从而对治疗效果造成不良影响，严重时还会导致药物不良反应[6]。因此开发即杀灭肺炎支原体又预防和治疗肺纤维素沉积的药物显得尤为重要。

芩百清肺浓缩丸（Qinbai Qingfei Concentrated Pills）是在临床研究基础上组成的具有治疗肺炎支原体肺炎作用方药[7]，Ⅲ期临床观察明确治疗小儿支原体肺炎。汉黄芩素（wogonin）又名5,7-二羟基-8-甲氧基-2-苯基-4-1-苯并呋喃-4-酮，是中药黄芩中的活性成分之一，也是芩百清肺浓缩丸中的主要活性成分。目前已有研究表明汉黄芩素有显著的抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤等多种作用[8]，并且能够明显抑制肺组织炎症相关因子的产生[9]，因此汉黄芩素很可能成为新一代治疗MPP的药物。

在EMT过程中上皮细胞丧失细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的降解细胞外基质的能力等间质表型[10]。其主要的特征有细胞黏附分子E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达减少、波形蛋白（vimentin）表达增加。且有研究表明，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在EMT转变起关键作用[11]。TGF-β1作为最主要的一种强效致纤维化因子，通过激活下游多个信号转导因子，在肺组织中诱导纤维化[12]。

本研究通过验证汉黄芩素对TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-钙黏蛋白表达的影响，探讨汉黄芩素治疗MPP的作用机制，为芩百清肺浓缩丸的临床使用提供理论依据。

1 材料

1.1 试剂及仪器

1.1.1 试剂 兔二步法检测试剂盒（兔增强聚合物法检测系统）购自北京诺博莱德科技有限公司（产品编号PV-9001），二抗批号2214B0114；DAB试剂购自Thermo公司（批号ZLI-9018）；Trizol购自美国Invitrogen公司（批号19124-1-AP）；UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司（批号29520）；Biacore T200试剂盒、CM5芯片购自GEHealthcare公司（批号10280148）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液购自南京建成公司；一抗TGF-β1（批号ab64715）、EGF（批号ab77815）、波形蛋白（批号ab45939）、E-钙黏蛋白（批号ab76055）均购自Abcam公司；引物合成自上海Invitrogen公司。

1.1.2 仪器 BIAcoreT200分子互作分析仪购自美国GE公司；Reverse Transcribe PCR仪Tc-24/H（b）购自中国博日生物公司；InfiniteM200PRO酶标仪购自瑞士TecanKD-BM公司；Waters ACQUITYTM UPLC色谱仪，美国Waters公司；AB SCEIX Triple-TOF TM5600+高分辨质谱，美国ABSCIEX公司；生物组织包埋机、KDTS3A自动组织脱水机购自浙江科迪仪器设备公司。

1.2 实验动物及病毒

6周龄SPF级BALB/c小鼠，雌雄各24只。体质量20～22 g，购自哈尔滨医科大学，动物合格证号SCXK（黑）2019-001，在GLP实验室室温25 ℃、湿度60%条件下饲养。本研究中的动物实验得到黑龙江省中医药科学院保护和使用委员会的批准（许可证号SY3R-2020006），实验过程依照《黑龙江省实验动物护理和使用指南》进行。肺炎支原体（ATCC 15531）购自American Type Culture Collection。

1.3 实验药品

芩百清肺浓缩丸购自天合力药业有限公司，生产批号CXZS1000045，规格为3 g/袋（相当于生药2.5 g）；汉黄芩素对照品由黑龙江省药品检验所提供（批号H01811804026），质量分数99%以上；阿奇霉素分散片购自石药集团欧意药业有限公司（批号274150404）。

2 方法

2.1 Biacore实验

2.1.1 预富集实验及配体耦联实验 参照徐明杭等[13]的前期实验，运用Biacore T200测试系统，用化学耦联法将TGF-β1蛋白偶联到CM5芯片上，在最佳pH 4的条件下，配制TGF-β1蛋白溶液200 μL注入芯片表面，体积流量10 μL/min，耦联时间600 s。

2.1.2 Biacore垂钓法钓取亲和成分 称取20 mg研磨成粉末状的芩百清肺浓缩丸药粉，加入1 mL超纯水中充分溶解后，用0.22 μm滤膜过滤到另一EP管中备用（芩百溶液）。将配制好的芩百溶液（20 mg/mL）注入CM5芯片表面，体积流量5 μL/min，耦联时间180 s。取2 μL样品回收液（0.5%甲酸溶液）注入流动池孵育20 s，使芩百溶液与TGF-β1的结合成分解离至样品回收液中。改变传感器表面样品的流动方向，使其朝相反方向流动，将含有结合成分的回收液沉积到10 μL的碳酸氢铵溶液（50 mmol/L）中，循环次数20次。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS鉴定有效成分

使用氮吹仪将Biacore垂钓所得样品吹干后溶解于100 μL甲醇溶液，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min，吸取上清液上机检测。色谱条件与质谱条件参照徐明杭等[13]实验条件。

2.3 汉黄芩素与TGF-β1蛋白的结合能力测试

称取1 mg汉黄芩素对照品，加入无核酸水配制成10 mg/mL的溶液。样品以30 μL/min经芯片表面，进样60 s，等待60 s，再生30 s。从输出的传感图结果中观察和分析响应值（RU）。

2.4 汉黄芩素与TGF-β1的亲和力分析

运用Biacore软件，根据汉黄芩素相对分子质量将其分别稀释成24.375、48.750、97.500、195.000、390.000 nmol/L的5个浓度梯度，再将不同浓度的溶液注入Biacore系统，注射60 s，体积流量30 μL/min，再生60 s。汉黄芩素溶液浓度97.500 nmol/L实验2次，总循环次数3次。最后利用软件中的亲和性分析模块分析实验结果。

2.5 分子对接模拟实验

利用软件Tripos Sybyl-X2.1.1和Discovery Studio 2016模拟分析汉黄芩素与TGF-β1之间的相互作用模式，运用Surflex-Dock软件对汉黄芩素与TGF-β1蛋白进行打分，判断二者之间的结合活性。

2.6 体内动物实验

2.6.1 肺炎支原体培养 在无菌环境中复苏肺炎支原体后培养在含胎牛血清的PPLO培养基中，37 ℃孵箱培养，每隔7 d传代1次。

2.6.2 小鼠肺炎支原体肺炎模型的建立 将48只雌雄各半的BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、阿奇霉素组（阳性对照组）以及汉黄芩素高、中、低剂量组，每组8只。除对照组外，各组小鼠乙醚麻醉后鼻滴入20 μL 106CCu肺炎支原体，每天1次，持续3 d。造模完成后，根据芩百清肺浓缩丸人用剂量进行折合计算，汉黄芩素各给药组小鼠分别ig给予148.54、74.27、37.14 μg/(kg·d) 汉黄芩素；阿奇霉素组小鼠给予阿奇霉素32 mg/(kg·d)；对照组和模型组小鼠ig等体积的生理盐水。连续给药7 d后脱颈处死小鼠，剥离各组小鼠肺组织，一半置于10%甲醛溶液中，一半−80 ℃冻存用于后续实验。

2.7 免疫组化（immunohistochemistry，IHC）法检测肺组织中TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-钙黏蛋白的表达水平

10%甲醛浸泡24 h后，取各组小鼠肺组织进行包埋切片，依据兔二步法检测试剂盒说明书进行免疫组化反应。在光学显微镜下对比观察各组小鼠肺组织中抗原分布，并对各组进行IHC评分。

2.8 HE染色

取各组小鼠肺组织切片，二甲苯脱蜡后进行HE染色，封片后置于显微镜下观察各组间肺组织病理变化。

2.9 Masson染色

取各组小鼠肺组织切片，二甲苯脱蜡后依次进行苏木素染色、立春红-酸性复红染色、1%磷钼酸染色和2%醋酸苯胺蓝染色。梯度酒精脱水后二甲苯浸泡，中性树脂封片后于显微镜下观察。

2.10 RT-PCR检测TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-钙黏蛋白mRNA的表达水平

取各组小鼠肺组织，根据RNA提取试剂盒提取各组小鼠肺组织总RNA，酶标仪检测各组RNA浓度。依照one-step reverse transcription PCR kit说明书检测、、波形蛋白和E-钙黏蛋白 mRNA的表达水平。其中各引物基因序列如下：，F：5’-AGAAACGAGCAGAGGATTGAGC-3’，R：5’-CTGAAAGTGTGGCAGGGACAA-3’；，F：5’-GTCACCCACAGAAACAAT-3’，R：5’-AGGAGCGAACCTACTAAA-3’；E-钙黏蛋白，F：5’- TAATTTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3’，R：5’-CACAACCAATCAACAACACA-3’；波形蛋白，F：5’-AATGGCTCGTCACCTTCG-3’，R：5’-CTAGTT- TCAACCGTCTTAATCAG-3’；β-actin，F：5’-CTGG- GACGACATGGAGAAAA-3’；R：5’-AAGGAAGGC-TGGAAGAGTGC-3’。

2.11 统计学方法

3 结果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS鉴定垂钓产物

在前期垂钓实验中回收到多个提取物，通过数据库对比，发现其中1种提取物的裂解规律与汉黄芩素一致。如图1-A、B所示，虚线部分为镜像分割线，其上部分为样品，下部分为汉黄芩素对照品，由图可见，垂钓产物二级碎片均与汉黄芩素对照品一致，可以确定芩百清肺浓缩丸回收样品中与TGF-β1蛋白结合的垂钓产物为汉黄芩素。见图1。

3.2 汉黄芩素与TGF-β1蛋白结合结果

如图2所示，汉黄芩素与TGF-β1存在结合解离峰，根据binding报告，二者的结合峰值为11.2 RU，而1 RU响应值大致相当于芯片表面结合物质的浓度改变了1 pg/mm2，预估结果在2～10 RU为结合良好，说明汉黄芩素与TGF-β1能够较好地结合。

图1 垂钓产物正(A)、负离子(B)模式下ESI-MS2质谱图

绿色线为2通道结合曲线；红色线为1通道结合曲线；棕色线为2、1通道结合曲线

3.3 汉黄芩素与TGF-β1亲和力分析结果

从图3可以看出，信号响应强度随着汉黄芩素溶液浓度的增加而逐渐增大，呈浓度相关性。表明汉黄芩素在体外能够与TGF-β1蛋白进行特异性结合。

3.4 分子对接结果

通过蛋白晶体研究及与配体相互作用研究，发现TGF-β1的活性口袋位于图4中红色球体所示的位置，是一个由芳香族氨基酸、非极性氨基酸和极性氨基酸组成的疏水口袋；其中有多个参与小分子药物作用的关键氨基酸残基，如Ile211、Ala230、Lys232、Leu260、Tyr282等。运用Surflex-Dock软件对汉黄芩素与TGF-β1蛋白之间的相互作用进行打分，判断二者之间结合活性，所得分数为5。利用软件Tripos Sybyl-X2.1.1和Discovery Studio 2016分析汉黄芩素与TGF-β1之间的相互作用模式，如图5所示。由图可知，汉黄芩素与TGF-β1受体之间存在多种相互作用，例如与Asp351形成的1条氢键，以及与Ile211形成的疏水作用力，而这些构成相互作用的氨基酸残基均为先前分析活性位点时找到的关键氨基酸残基；同时，汉黄芩素亦与活性口袋中其他关键氨基酸残基形成了多种其他非键相互作用力。这说明汉黄芩素确实可以有效地与TGF-β1受体结合。

图3 梯度浓度的汉黄芩素与TGF-β1蛋白结合响应值

图4 汉黄芩素与TGF-β1模拟分子对接示意图

3.5 IHC法检测汉黄芩素对肺组织中TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-钙黏蛋白表达的影响

在200倍镜下观察各组小鼠肺组织的染色情况，每张切片随机选取3个不同的视野，对各组进行IHC评分。评分标准：组织切片IHC评分＝着色强度分×阳性细胞着色比例分；着色强度分：不着色0分，弱着色1分，中等着色2分，强着色3分；阳性细胞比例评分：0～5%阳性0分，6%～25%阳性1分，26%～50%阳性2分，51%～74%阳性3分，＞75%阳性4分[14]。通过观察，汉黄芩素中、高剂量组与模型组对比，TGF-β1、波形蛋白的表达均明显减少（＜0.05、0.01），EGF、E-钙黏蛋白的表达均不同程度有所升高（＜0.05、0.01），表现为褐色着色点加深。见图6、7。

图5 汉黄芩素与TGF-β1相互作用二维图（软件：Discovery Studio 2016）

3.6 HE染色

200倍显微镜下观察，结果如图8所示，对照组小鼠肺组织形态正常，肺泡细胞排列紧密。模型组小鼠肺组织中肺泡壁有明显增厚，且有大面积充血，肺泡腔多处塌陷。汉黄芩素各给药组对比模型组，有少量肺泡壁充血和炎性细胞浸润，与对照组和阳性对照阿奇霉素组的肺组织相似，且汉黄芩素高剂量组的治疗效果最好。

图6 汉黄芩素对肺组织TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-钙黏蛋白表达的影响(×20)

与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01

图8 各组小鼠肺组织HE染色(×200)

3.7 Masson染色

将染色切片置于显微镜200倍镜下观察，结果如图9所示，对照组小鼠肺组织切片组织排列紧密规则，在血管周围存在极少量纤维沉积。模型组小鼠肺组织形态紊乱，且有大量胶原纤维（呈蓝色）分布，肺泡腔塌陷，肺泡壁周围有大量炎性细胞聚集。与模型组相比，汉黄芩素各给药组蓝色面积都有显著减少，其组织形态与对照组和阳性对照阿奇霉素组的肺组织相似，且治疗效果随汉黄芩素剂量的降低而减弱。

3.8 RT-PCR检测汉黄芩素对TGF-β1、EGF、波形蛋白、E-钙黏蛋白mRNA表达的影响

汉黄芩素对、、波形蛋白、E-钙黏蛋白mRNA表达的影响如图10所示。与模型组相比，汉黄芩素各剂量组的和波形蛋白mRNA表达明显降低，与E-钙黏蛋白的mRNA表达均有不同程度升高（＜0.05、0.01、0.001）。

图9 各组小鼠肺组织Masson染色(×200)

与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

4 讨论

芩百清肺浓缩丸最早由黑龙江省中医药科学院研发，在临床上多用于止咳化痰平喘。目前已有的研究证实芩百清肺浓缩丸可抑制肺泡上皮细胞分化，促进肺组织修复[15]，能降低MPP的纤维化因子表达，起到抗纤维素沉积的作用[16]。但对于其中的活性成分汉黄芩素的作用机制目前仍不明确。

肺炎支原体侵染肺组织致使的肺纤维化主要作用机制包括炎症反应、EMT等[17]。目前已有研究证实TGF-β1为EMT的主要诱导剂[18]，主要负责肺成纤维细胞的增殖和胶原的合成[19]。

本研究通过前期体外分子对接模拟汉黄芩素与TGF-β1的结合，以及后续的体内动物实验，探讨汉黄芩素干预后小鼠肺组织中间质形成相关因子表达水平的变化，以此确定MPP所致EMT的作用机制。实验结果表明，未施加汉黄芩素干预的模型组小鼠肺组织中有大量的TGF-β1和波形蛋白蛋白的表达，且通过切片观察到肺各组织中发生了不同程度的病变，表现为肺泡壁塌陷，炎性细胞增多，肺泡周围出现大量胶原纤维沉积，这也进一步证实在肺炎支原体侵染肺部组织时，存在TGF-β1诱导EMT的过程。而通过汉黄芩素治疗后的MPP小鼠肺组织形态结构治愈情况良好，肺组织中的胶原纤维和炎性细胞也有所减少，TGF-β1和波形蛋白的表达显著减少。该结果表明汉黄芩素抑制小鼠肺部炎症反应和肺纤维化的形成可能是通过降低肺组织中TGF-β1的表达，以此来抑制EMT过程。而EGF对于细胞的增殖、分裂有着重要的作用，能够促进组织损伤部分的修复愈合[20]。伴随着TGF-β1表达的降低，汉黄芩素各给药组的mRNA表达量都有所升高，上皮标志物E-钙黏蛋白的表达也与TGF-β1呈现负相关的趋势。

综上所述，汉黄芩素能够起到治疗MPP以及肺纤维化疾病的效果，其作用机制可能是一方面通过降低TGF-β1和波形蛋白的表达，抑制EMT过程的发生；另一方面提高EGF和E-钙黏蛋白的表达来实现的。且对比汉黄芩素各给药剂量组之间的差异可以看出，高剂量的汉黄芩素治疗效果最为突出。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Effect of wogonin on expression of lung epithelial-mesenchymal formation factor in lung tissue of mycoplasma pneumoniae pneumonia mice

WANG Si-chu, SUN Yi, WANG Xiao-xi, WANG Xin, MENG Yan-li, WANG Wei-ming

Heilongjiang Academy of Chinese Medicine Sciences, Harbin 150036, China

To investigate the mechanism of wogonin in the treatment of mycoplasma pneumoniae pneumonia by regulating the expression of epithelial-mesenchymal formation factor.UPLC-Q-TOF-MS was used to detect the active ingredient wogonin in Qinbai Qingfei Concentrated Pills (芩百清肺浓缩丸), and it was bound to transforming growth factor-β1 (TGF-β1) by Biacore fishing technique, and the specificity of binding was verified by kinetic analysis. Tripos SYbyl-X2.1.1 and Discovery Studio2016 software was used to perform molecular docking between wogonin and TGF-β1, and the binding mode between drug molecules and receptor proteins was visualized. The lung pathological tissue sections of mice were prepared by animal experiments. Hematoxylin-eosin (HS) staining and Masson staining were performed to observe the pathological structure and morphology of the staining. The effects of wogonin on mRNA and protein expression levels of TGF-β1, epidermal growth factor (EGF), vimentin, E-cadherin in mouse lung tissue by real-time (RT) -PCR and immunohistochemistry method.The samples obtained from Biacore fishing were identified and analyzed as wogonin by UPLC-Q-TOF-MS. There was strong specific binding between wogonin and TGF-β1. The results of HE staining and Masson staining showed that the morphological structure of lung tissue in the wogonin group was similar to that of the control group. Immunohistochemical test results showed that compared with model group, the expression levels of TGF-β1 and vimentin in medium and high dose wogonin groups were significantly decreased (< 0.05, 0.01), and the expressions of EGF and E-cadherin were increased (< 0.05, 0.01). The results of RT-PCR showed that compared with the model group, the mRNA expression levels ofandin lung tissue of mice in wogonin administration groups was significantly decreased (< 0.05, 0.001), while the mRNA expression levels ofandwas significantly increased (< 0.05).Wogonin can down-regulate the expression of TGF-β1 and vimentin, and up-regulate the expression of EGF and E-cadherin, so as to achieve the purpose of treating mycoplasma pneumoniae pneumonia and lung tissue fibrosis.

mycoplasma pneumoniae; wogonin; epithelial-mesenchymal transitions; epidermal growth factor; E-cadherin; transforming growth factor-β1; vimentin

R285

A

0253 - 2670(2023)01 - 0172 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.020

2022-08-21

国家自然科学基金项目（82174060）；黑龙江省自然科学基金项目（LH2021H074）；黑龙江省卫生健康委科研课题（20210202040011）

王斯楚（1998—），女，硕士研究生，主要从事中药学研究。E-mail: 840074577@qq.com。

通信作者：蒙艳丽（1976—），女，硕士生导师，研究员，主要从事新药研发。E-mail: mengyanli2000@163.com

王伟明（1966—），女，研究员，博士生导师，研究方向为中药新产品研发、药食同源中药发酵。E-mail: wangweiming475@yahoo.com

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