不同频率电针内关穴浅、深层次对心律失常家兔刺激效应的比较研究*

杨守亲 古春凌 张硕峰 林 怡 彭 超 吴晓玲 徐 畅 孙千惠 杨智文 高小峰 程 凯

（北京中医药大学，北京 100029）

内关穴作为心律失常的常用穴，古文献记载［1］及现代临床［2］都已证实其在治疗心系病中有着特异性优势。在影响针效的因素中，针刺深度和刺激参数都发挥着关键性作用，程莘农院士认为甚至可以起到直接决定作用［3］。《素问·刺要论》中“病有浮沉，刺有浅深，各有至理，无过其道”。已认识到穴位层次对疗效的差异。杨继洲则将穴位层次与补泻手法相结合，并以此来区分刺激量的轻重，提出“刺有大小”的理论。而现代关于穴位层次和刺激量的研究多集中于单一因素［4］。针刺深度上，已有文献主要分为两种观点“深刺优于浅刺”［5-6］及“深浅刺疗效无差别”［7］。而两种观点不一致的原因是否在于没有对刺激量加以把控？且有学者发现［8］，不同频率电针存在刺激效应的差异。因此，本课题将两因素综合考虑，采用心血管疾病中常见的2、20、100 Hz［9-10］作为低中高频代表；并为防止电流耗损、层次叠加效应，采用只在针尖处放电的绝缘针作为施术针具，观察两因素对家兔心律失常在心肌形态和钠钾泵功能上的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰雄性大耳白兔52只，体质量2.0～2.5 kg，3月龄。购自北京富龙腾飞养殖中心，许可证号：SCXK（京）2018-0009，于北京中医药大学动物房正常饲养。实验前将家兔用剃毛器剔除左前肢前臂内侧面兔毛，以准确取穴。此过程中对家兔的操作均符合科技部颁布《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 试剂与仪器 水合氯醛（北京虹湖化工，B861682-100 g），氯化钡（北京虹湖化工，C804539-100 g），BL-420N生物信号采集分析系统（成都泰盟），绝缘针（无锡佳健，直径0.3 mm×13 mm、针尖裸露3 mm，针身专利纳米涂层），华佗SDZ-V电针治疗仪（苏州医疗用品厂），EG1150H石蜡包埋机（德国Leica），正置显微镜（德国尼康），Beckmancoulter UniCel DxC 600 Synchron全自动生化分析仪（美国），超微量Na+-K+-ATPase测定试剂盒（Na+-K+-ATPase assay kit RGB&CHN Lot：20210622.40041）

1.3 分组与造模 将家兔按随机数字表法分为空白组、模型组、浅层组（2、20、100 Hz）、深层组（2、20、100 Hz）共8组，排除造模死亡和造模之前已有心律失常家兔剩48只，每组各6只。家兔称重后，按体质量0.5 g∕kg腹腔给药水合氯醛。家兔麻醉后，腹面朝上固定在兔台上，用一次性针灸针刺入家兔四肢远节皮下，针柄处连接BL-420N三头电极，红色接右前肢、黑色接右后肢、绿色接左后肢，选择ECG模式。观测心电5 min，剔除先天有心律失常的家兔。空白组经耳缘静脉快速推注（4 s）0.9%氯化钠溶液（1 mL∕kg）。模型组及治疗组则快速推注0.4%氯化钡溶液（1 mL∕kg），以给药后示波器出现连续宽大畸形的QRS波群为造模成功［11］。

1.4 干预方法 各治疗组造模成功后即刻取内关穴，定位参照《实验针灸学》［12］标准，于家兔左前肢内侧下1∕6折点处（约在腕关节上1.1 cm）、腕桡侧屈肌与指浅屈肌之间。浅层组［13］用0.3 mm×13 mm绝缘针直刺3 mm，确认刺入浅筋膜层且针尖止于肌肉表面后，用同样的方法在内关穴上3 mm处采用同样的进针深度刺入第二根绝缘针，接通电针仪，连续波，持续20 min，频率根据组别分别选 2、20、100 Hz；深层组［13］直刺内关穴5～8 mm，适当调整针尖方向以触发正中神经出现过电样抽搐为度，余操作同浅层组。

1.5 观察指标 1）心律失常持续时间。家兔麻醉后，ECG持续监测心电活动直至恢复窦性心律持续300 s，视为大致恢复正常心电图［14］。以造模成功后第一个宽大畸形的Q波为开始时间，以大致恢复正常心电图的第一个窦性P波为结束时间。2）心肌组织形态。观测结束后，在家兔麻醉尚未苏醒的情况下（若有苏醒，则按体质量0.5 g∕kg腹腔注射水合氯醛），剪开左侧胸骨剪断心底部血管，并取左心室前壁心肌一分为二，一份置于10%甲醛溶液固定1周左右，经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片（厚度4 μm）后，用苏木精-伊红进行染色，置于显微镜下观察。3）心肌组织Na+-K+-ATP酶浓度。左心室前壁心肌另一份留存于冻存管并置于-80℃冰箱备用待测。取样本按照1∶10体积比加入生理盐水进行匀浆，每组样本设对照管进行酶促反应、定磷、再按照总蛋白测定试剂盒说明加入1 mL工作液，混匀，37℃水浴10 min，546 nm波长，空白管（蒸馏水）调零，标准液定标，测定每份样品的总蛋白浓度，具体操作参照说明书进行。

1.6 统计学处理 应用SAS9.2统计软件。计量资料以（x±s）表示，两组数据均正态且方差齐时，用独立t检验；3组及以上用单因素方差分析；分析两因素交互作用时用（2×3）析因分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组家兔心律失常持续时间比较 与空白组相比，其余各组均出现心律失常，以室性心动过速（VT）或室颤（VF）为主，提示心律失常建模成功。与模型组比较，2 Hz浅层组无统计学差异，其余治疗组持续时间均有缩短（P＜0.05），其中20 Hz深层组能显著缩短持续时间（P＜0.01）。各治疗组之间，20 Hz深层组＜2 Hz深层组＜100 Hz深层组＜20 Hz浅层组＜100 Hz浅层组＜2 Hz浅层组，见表1，图1。

表1 各组家兔心律失常持续时间比较（min，±s）

表1 各组家兔心律失常持续时间比较（min，±s）

注：与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别空白组模型组2 Hz浅层组20 Hz浅层组100 Hz浅层组2 Hz深层组20 Hz深层组100 Hz深层组死亡（n） 使用（n） 持续时间0△△69.36±3.72 64.56±4.58 32.14±3.94△49.33±3.56△27.89±3.34△21.12±2.34△△30.58±4.77△0 2 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6 6 6 6 6

图1 各组家兔心律失常持续时间的比较（±s）

2.2 各组心肌病理形态学比较 空白组镜下观察心肌细胞呈长带状，细胞核1～2个，形似椭圆或长方形，核周染色浅。肌原纤维排列整齐，周期性横纹清晰。细胞之间有规则的闰盘连接。模型组心肌切面肌纤维排列紊乱，嗜酸性增强，间质中有红细胞渗出，闰盘增厚，并可见到大量空泡，细胞核肿大。2 Hz浅层组、100 Hz浅层组可见到肌纤维明显紊乱，闰盘增厚，细胞核肿大；20 Hz浅层、2 Hz深层、100 Hz深层可见肌原纤维排列不整齐，细胞核肿大，可见个别空泡样改变。20 Hz深层组心肌纤维基本排列整齐，边缘清晰，未见渗出，见图2。

图2 各组家兔心肌病理变化（HE，200倍）

2.3 各组家兔心肌组织中Na+-K+-ATP酶浓度比较与空白组比较，模型组心肌Na+-K+-ATP酶值降低（P＜0.05）。20 Hz浅层组及2、20、100 Hz深层组与模型组比较有统计学差异（P＜0.05）。见表2。

表2 各组家兔心肌Na+-K+-ATP浓度比较（U∕mg，±s）

表2 各组家兔心肌Na+-K+-ATP浓度比较（U∕mg，±s）

组 别 死亡（n） 使用（n）Na+-K+-ATP空白组模型组2 Hz浅层组20 Hz浅层组100 Hz浅层组2 Hz深层组20 Hz深层组100 Hz深层组0 2 0 0 0 0 0 0 6 6 6 6 6 6 6 6 6.818±0.466△4.588±0.510 4.670±0.509 5.940±0.684△4.616±0.455 5.906±0.845△6.625±1.432△5.913±0.723△

3 讨 论

氯化钡以其操作简单、可重复性好的优点常作为诱发心律失常药物。给予家兔4 mg∕kg，心律失常持续时间稳定在（69.36±3.72）min，类型主要为VT或VF，与报道一致［11］。

心律失常可引起心肌缺血缺氧，引起胞内脂肪酸β-氧化以及糖酵解产生有害的氢离子［15］，改变细胞内环境，因此HE染色出现嗜酸性增强的表现；渗透压增高，则导致心肌细胞肿大。研究表明［16］，心肌缺血不仅累及心肌纤维，还影响细胞间闰盘结构。正如模型组切片所见，心肌间隙增宽，闰盘增厚，而各治疗组都有不同程度的改善。心律失常发生时常伴随、Na+、K+、Ca2+流向的改变［17］。而心肌中Na+-K+-ATP酶能通过水解ATP逆胞膜两侧电化学梯度转运Na+、K+，来达到改变电位差对抗心律失常；而当酶活性受抑制时，膜两侧离子可出现异常分布，引起Ca2+超载进而损伤心肌结构［18］。本结果表明，模型组Na+-K+-ATP酶值下降明显，引起膜两侧离子流发生改变，出现了严重的心律失常，结合HE染色可知，钙超载引起部分胞膜发生破裂出现细胞结构改变。治疗组除2、100 Hz浅层外，酶活性有不同程度地提高，心律失常持续时间也有缩短，提示电针内关穴对抗心律失常的作用途径可能与调节心肌细胞膜上的Na+-K+-ATP酶活性有关。

古人认为针刺取效在于调气，疾病所在部位层次不同决定了同一穴针刺深度不同。如《灵枢·九针十二原》强调“刺之要，气至而有效”，还提到“疾浅针深，内伤良肉……浅深不得，反为大贼”。针刺深度超过疾病所在层次可能会导致损伤，并提出五体（皮脉肉筋骨）辨病定位依据以及对应的五种针刺深度；到了近现代，程莘农院士［3］提出“三才针法”将针刺深度进一步具体化。学者们逐渐意识到针刺深度不同存在刺激效应的差异，并推测穴位各层次上组织结构分布不同是差异产生的结构基础。如崔氏［19］发现，浅深刺能分别提高慢性炎性痛大鼠不同种类疼痛的阈值，并推测其与穴位浅深层次上神经支配、化学特征等不同有关。内关穴是一个立体的三维空间结构，针刺深度不同所刺激到的感受器不同。研究认为［20］，内关穴调节心律失常主要与正中神经有关。基于此，我们前期观察了［13］内关穴浅层针深3 mm不触及正中神经对家兔心律失常的影响并与深层5～8 mm触及正中神经进行比较。结果发现，内关穴浅层同样有对抗心律失常的作用，且浅深层次不存在效应差异。但此操作过程中未对刺激参数进行把控，而刺激参数也会对针刺效应产生影响。《灵枢》将针刺手法分虚实从侧面表明灵素时期已经认识到刺激量大小的差异。杨继洲、徐凤等具体描述不同手法并用于治疗不同性质的疾病。近代石学敏院士［21］将手法进行了量学规范。电针取代传统手法具有客观、稳定持久的优点常用于临床和科研研究中，其同样存在量学差异。贾萍［22］以3、20、100 Hz为低、中、高频代表观察对家兔胃节律亢进的效果，结果20 Hz电针表现最优。其原因可能与神经体液分泌有关，但确切机制还尚待证实。陈凌［9］的研究采用同样的低中高频观察对乌头碱诱发的心律失常的影响，20 Hz中频表现最佳并推测其作用机制可能与通过抑制Na+内流，延迟有效不应期、保护心肌减少炎性反应等有关。针刺镇痛领域对差异性机制研究较多，并已证实不同频率对脑区中核团有所偏好，脉冲频率对激活中枢神经系统肽类物质释放有关键性作用［23］。

本课题以心血管疾病中常见的电针频率2、20、100 Hz作为低、中、高频代表并结合内关穴浅深层次来观察比较对心律失常模型的影响，结果提示：1）内关穴浅深层均可对抗心律失常，且深层略优于浅层；这说明内关穴对抗心律失常不但与深层的正中神经有关，浅层也存在负责传导针刺信号的通道。结合穴位解剖层次分析，可能与游离神经末梢、环层小体或桡神经浅支或交感神经节后纤维等感受器密切相关。张承舜［24］在健康男性内关穴浅深刺对神经传导影响研究中，指出浅刺信号可能主要由前臂内、外侧皮神经传导，深刺则主要为正中神经。且浅深刺神经传导无显著性差异，但浅刺产生的波幅低于深刺，可能与两种刺激条件下兴奋的运动纤维数量、类别不同有关。本研究观察到深层效果略优于浅层，可能与深层可直接兴奋正中神经，并通过调控外周神经活动改善自主神经活性来对抗心律失常有关；而浅层虽存在针刺信号传导途径但在神经调节中对运动纤维数量兴奋较少，传达出的刺激信号强度弱于深层。2）从电针频率影响作用上看，低频2 Hz产生的刺激效应较弱甚至是无；随频率增加，刺激效应逐渐增加；当刺激量增大到一定程度时，效应增加趋势有所减缓。临床上将超出疾病所需阈值的刺激量称为“无效治疗量”［25］，超出部分并不会使刺激效应增大而提高疗效，甚至可能带来不必要的损伤［26］。穴位浅深层次上呈现同样的趋势，提示针对具体疾病，电针存在适宜频率，不及和过强都不能发挥穴位的最佳效应。下一步可增加研究频率的分布密度，绘制出大致的量效曲线图以便直观地反映频率与刺激效应之间关系。近年来出现了只刺激穴位浅层的新兴针法和理论如符氏浮针［27］、腕踝针［28］等逐渐得到学界认可，且患者易于接受并取得满意疗效。国外如日本针灸界追求轻刺激，推行“浅刺”“细针”“套管针”，受到患者的欢迎［29］。笔者认为临床上面对具体疾病时，在考虑获得最佳疗效的同时，也应平衡患者感受，一味追求强刺激可能会引起患者情绪紧张导致机体机能状态发生改变进而影响疗效。过强的刺激可能还会带来不必要的损伤引发患者抵触心理影响医患配合度，同样也会对针效产生折扣。

综上所述，穴位效应的发挥与针刺深度、刺激频率密切相关，因此对量效关系的研究也应考虑二者关系。目前大多数研究将二者进行单因素分析可能一定程度上会使结论片面，对影响因素多重考虑才能更贴近临床实际，更好地为临床提供参考。