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基于TLR4∕NF-κB信号通路探讨银莱汤治疗幼龄大鼠肺炎模型的作用机制*

2023-01-10龙超君朱敬儒卓丽清刘邵阳谷晓红刘铁钢

中国中医急症 2022年12期
关键词:泼尼松醋酸通路

胡 莉 白 辰 龙超君 朱敬儒 卓丽清 刘邵阳 于 河 谷晓红 刘铁钢

(北京中医药大学,北京 100029)

小儿肺炎是由病原体感染或其他因素所致的肺部炎症,冬春季发病较多,临床以发热、咳嗽、痰壅、气息、鼻煽为主要症状[1]。小儿肺炎是婴幼儿死亡的常见原因,为我国重点防治的小儿疾病。西医治疗本病以予抗生素、抗病毒药物等为主,长期使用易产生耐药性以及许多不良反应。中医治疗小儿肺炎在缩短疾病疗程,改善临床症状及减少不良反应方面具有显著优势。

银莱汤是首都名中医谷晓红教授的临床验方,该方以肺与胃肠同治法组方,由金银花、莱菔子、黄芩、连翘、鱼腥草、全瓜蒌、前胡组成,肺胃两清、宣通,临床治疗小儿胃肠积热合并肺炎疗效确切。前期研究发现,银莱汤具有明确治疗肺炎的作用[2-3],但其作用机制并未明确。本研究建立脂多糖(LPS)诱导的幼龄大鼠肺炎模型,旨在探究银莱汤对幼龄大鼠肺炎模型的抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠40只,4周龄,体质量(100±10)g,购自维通利华(北京)实验动物中心,合格证号110011211102012854。动物饲养于北京中医药大学的基础医学科学院的动物实验中心,自由摄食和饮水,室温(25±2)℃,相对湿度50%~60%,昼夜12 h交替。适应性喂养3 d后进行实验,所有动物实验均严格按照实验动物管理法规的规定和总则建议进行(伦理审批号BUCM-4-2021030305-1046)。

1.2 试药与仪器 银莱汤中药配方颗粒全方由金银花30 g,莱菔子10 g,黄芩10 g,连翘15 g,全瓜蒌15 g,前胡10 g,鱼腥草20 g组成,加水煎制浓缩为质量浓度为0.56 g∕mL的药液(药材购自北京康仁堂药业有限公司)。LPS,购自美国Sigma公司,批号:L2880。醋酸泼尼松片,购于浙江仙琚制药股份有限公司。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA-Ki(t武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,E-EL-R2856c)、白细胞介素-6(IL-6)ELISA-Ki(t武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,EEL-R0015c)、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA-Kit(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,E-EL-R0012c)。兔多抗tlr4(武汉三鹰生物技术有限公司,SC-109312)、兔多抗P65(武汉三鹰生物技术有限公司,10745-1-AP);鼠单抗IκBα[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,4814];兔单抗p-ikbα(美国Abcam公司,Ab133462)、兔单抗TRAF6(美国Abcam公司,Ab133462)、兔多抗myd88(美国Abcam公司,SC-109312);HRP标记羊抗小鼠二抗(武汉博士德生物工程有限公司,BA1051)、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司,BA1054);ECL底物液(北京普利莱基因技术有限公司,P1050)。主要仪器:微型高速离心机,美国Labnet公司;电热恒温培养箱,日本ASONE公司;DYCZ-40电转仪、DYCZ-24DN垂直电泳槽、DYY-7C电泳仪电源,北京六一仪器厂;全自动酶标仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;402B超声雾化机,江苏鱼跃医疗设备股份有限公司。

1.3 造模与分组 将4周龄大鼠适应性喂养3 d后,按体质量随机分为4组,每组10只,分别为正常组、模型组、银莱汤组、醋酸泼尼松组。

1.4 干预方法 模型组、银莱汤组、醋酸泼尼松组每天早晚2次固定时间以LPS水溶液(0.5 mg∕mL)15 mL雾化吸入造模,每次30 min,连续3 d;正常组同样的时间予以15 mL纯水雾化吸入。每天早晚固定时间使用LPS雾化吸入建立肺炎模型后,银莱汤组予5.6 g∕kg银莱汤灌胃,醋酸泼尼松组予2.1 mg∕kg醋酸泼尼松溶液灌胃,共给药3 d。3 d后大鼠禁食不禁水12 h,采用10%水合氯醛40 mL∕kg麻醉后进行后续操作,从腹主动脉采集血液,取肺组织。

1.5 标本采集与检测 1)肺、胸腺脏器指数,腹主动脉取血后,取大鼠肺和胸腺,用0.9%氯化钠溶液冲洗干燥。使用数字毫米秤称重组织,计算脏器指数,公式如下:器官质量∕体质量×100%。2)大鼠切除肺脏称重后,切取左肺一部分固定于10%甲醛溶液12 h,在石蜡包埋机中包埋后切成5 μm厚的切片,然后行常规苏木精-伊红(HE)染色。置于显微镜下观察肺组织病理学变化,观察肺泡上皮细胞的损伤程度和肺泡壁增厚程度。3)ELISA测定血清中炎症因子水平,大鼠经腹主动脉取血后,3 000 r∕min 4℃离心10 min,取上清,按照ELISA试剂盒操作说明,检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子的含量。4)Western blotting检测大鼠肺组织蛋白表达水平,取大鼠的肺组织,液氮速冻后,-80℃保存备用。肺组织加入RIPA裂解液裂解匀浆,提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度,等量蛋白经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,分别加入GAPDH(1∶1 000)、TLR4(1∶800)、MyD88(1∶800)、TRAF6(1∶2 000)、NF-κBp65(1∶1 000)、p-IKBα(1∶10 000)、IKBα(1∶1 000)一抗,4 ℃孵育过夜,TBST漂洗3次,每次10 min,室温二抗孵育90 min,TBST漂洗3次,每次10min,ECL反应,采集图像。采用Image J软件分析灰度值以统计蛋白表达量。

1.6 统计学处理 所有实验数据保留两位小数,应用SPSS26.0统计软件。正态分布的数据以()表示,以单因素方差分析进行组间差异比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺、胸腺脏器指数比较 见表1。与正常组相比,模型组、银莱汤组、醋酸泼尼松组大鼠的肺脏器指数均有不同程度的升高(P<0.01)。与正常组相比,模型组、银莱汤组大鼠的胸腺脏器指数有下降趋势,但无统计学意义(P>0.05),醋酸泼尼松组大鼠的胸腺脏器指数呈现明显下降(P<0.01)。

表1 各组大鼠肺、胸腺脏器指数比较(%,±s)

表1 各组大鼠肺、胸腺脏器指数比较(%,±s)

注:与正常组比较,**P<0.01。

组别正常组模型组银莱汤组醋酸泼尼松组胸腺0.42±0.03 0.37±0.03 0.38±0.03 0.34±0.05**n 肺10 10 10 10 0.55±0.02 0.94±0.07**0.97±0.09**0.96±0.09**

2.2 各组大鼠肺组织病理变化 见图1。HE染色结果显示,正常组大鼠肺泡形态规则,结构清晰完整,基本正常,未见出血及炎性细胞浸润。与正常组比较,模型组大鼠肺组织细胞膜破坏,肺泡结构杂乱,肺泡壁增厚,肺泡腔内可见大量炎性细胞及红细胞。银莱汤组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织均出现不同程度的病变改善。

图1 各组大鼠肺组织病理变化(HE染色,200倍)

2.3 各组大鼠血清中炎症因子表达水平比较 见表2。与正常组比较,模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较,银莱汤组和醋酸泼尼松组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显降低(P<0.01)。

表2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平比较(pg∕mL,±s)

表2 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平比较(pg∕mL,±s)

注:与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05,△P<0.01。下同。

组别正常组模型组银莱汤组醋酸泼尼松组n 6 6 6 6 TNF-α 140.45±14.27 465.83±35.08**318.14±21.14△△273.44±31.58△△IL-6 87.31±5.92 248.27±14.10**161.69±15.64△△144.81±14.55△△IL-1β 107.05±15.36 348.00±31.09**231.65±20.90△△194.09±17.03△△

2.4 各组大鼠肺组织蛋白水平比较 见表3,图2。与正常组比较,模型组大鼠肺组织TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα相对表达明显升高(P<0.05或P<0.01),IKBα相对表达明显降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,银莱汤组和醋酸泼尼松组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB-p65、p-IKBα蛋白表达明显降低(P<0.05或P<0.01),IKBα相对表达明显升高(P<0.05或P<0.01)。

表3 各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κBp65、p-IKBα、IKBα蛋白表达水平比较(±s)

表3 各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κBp65、p-IKBα、IKBα蛋白表达水平比较(±s)

组别正常组模型组银莱汤组醋酸泼尼松组n 3 3 3 3 TLR4 0.13±0.03 0.58±0.12**0.38±0.06△0.24±0.02△△MyD88 0.12±0.00 0.66±0.05**0.49±0.03△0.39±0.11△△TRAF6 0.14±0.03 0.64±0.06**0.43±0.03△△0.29±0.02△△NF-κB p65 0.24±0.08 0.82±0.08**0.56±0.07△△0.41±0.06△△p-IKBα 0.12±0.04 0.58±0.05**0.36±0.04△△0.25±0.05△△IKBα 0.54±0.04 0.11±0.01**0.27±0.07△0.35±0.06△△

图2 各组大鼠肺组织TLR4、TRAF6、MyD88、NF-κB p65、p-IKBα、IKBα蛋白表达比较

3 讨论

小儿肺炎的急性病程以肺热证为主,在此阶段及时进行干预是该病治疗的关键。目前,在小儿肺炎肺热证阶段的治疗以宣肺化痰为主,注重清热解毒,治疗病位主要在肺。银莱汤是北京中医药大学谷晓红教授的治疗小儿肺炎的经验方,以肺胃同治为主要治法[2],由金银花、莱菔子、连翘、黄芩、鱼腥草、瓜蒌、前胡组成。回顾性病例系列研究发现,银莱汤可明显改善患儿机体状态,治疗效果总有效率可达95%,治愈率达85%[2-3]。研究表明,银莱汤对发热大鼠有明显的抗炎退热作用[4],能通过调节免疫球蛋白和细胞因子的分泌来调节小鼠免疫功能,发挥其抗流感病毒的功效,达到治疗食积复合流感病毒致小鼠肺部炎症损伤的作用[5-7]。网络药理学分析显示,银莱汤可通过调控以TLRs、NF-κB、TNF等为主的信号通路来调节宿主免疫炎症反应、血管生成和血管通透性、激素释放和细胞生长、增殖和凋亡,来减轻肺部炎性症状[8-9]。

Toll样受体是一类模式识别受体(PRRs),它通过识别外源性、内源性配体激活天然免疫[10],其介导的信号通路在炎症的发生发展中起重要作用[11]。在经典途径中,TLR4的激活是从LPS与血清中LPS结合蛋白(LBP)相互作用开始的级联事件[12]。TLR4∕NF-κB通路是近年来发现与抗炎免疫机制密切相关的信号通路,NF-κB的异常活化会引起炎性细胞因子的失控释放,是导致肺损伤的重要机制[13]。NF-κB转录因子受多种上游信号分子的刺激而激活,TLR4是其中之一。LPS作为TLR4的典型配体,能被TLR4识别并以LPSCD14-MD-2复合物的形式激活细胞内的LPS-TLR4-MyD88-NF-κB 信号通路[14-15]。LPS刺激机体后,TLR4衔接蛋白MyD88募集IRAK4和IRAK1(或IRAK2)[16];并激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6),使其发生低聚化[17];活化的TRAF6募集并激活 TGF-β活化激酶 1(TAK1),TAK1结合蛋白1(TAB1)和TAK1结合蛋白2(TAB2)形成络合物,该络合物诱导激活IKKs复合物。NF-κB在静息状态下以三聚体形式的p50-p65-IκB存在于细胞质中[18]。IKKs复合物是IκB激酶,主要由两个催化亚基IKKα、IKKβ和一个调节亚基IKKγ组成,是激活IκB的关键蛋白,也是NF-κB通路活化的主要启动点[19]。p65、IκBα的磷酸化水平是证实NF-κB通路活化的重要检测指标[20]。LPS可使IκB激酶激活致NF-κB磷酸化,IκB解离,NF-κB进入细胞核与DNA特定的κB序列结合后活化和核转移,高效诱导促炎因子、黏附分子及趋化因子的基因转录[21]。其中诱导促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生,促发更强的炎症反应。

本研究结果显示,LPS激活了幼龄大鼠肺组织的TLR4,使得TLR4信号通路上的MyD88、TRAF6蛋白增多,促进了IκBα磷酸化,致IκBα蛋白降低,p-IκBα蛋白数量增多,NF-κB磷酸化活化入核,促进促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的增加,造成肺部炎症,损伤肺组织结构。给予银莱汤和醋酸泼尼松后,可减轻LPS引起的肺部炎症和肺组织损伤,均可调控TLR4∕NF-κB信号通路上TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα、IKBα蛋白水平的表达,及降低血清炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。另外,醋酸泼尼松虽能有效抗炎、抗过敏,降低毛细血管通透性,抑制结缔组织增生,缓解炎症症状,但该药长期使用不良反应明显,临床应严格控制剂量及应用时间[22-23]。与醋酸泼尼松组的模型动物相比,银莱汤组的胸腺指数变化不大,提示该方对机体有一定的保护作用。

综上所述,本研究结果表明银莱汤给药对LPS诱导的幼龄大鼠肺炎模型具有较强的保护作用,其作用机制与减少肺部组织炎性病变、降低血清中炎症因子水平以及下调TLR4∕NF-κB炎症信号通路有关。

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