农杆菌介导单子叶植物遗传转化研究进展

刘文欣

（山东农业大学 生命科学学院，山东 泰安 271018）

植物遗传转化即转基因技术，是指将来自某一生物的目的基因或外源基因进行切割重组后引入植物，并使该基因在受体中稳定地表达、转移并获得所需性状的技术［1］。农杆菌具有对双子叶植物的创伤部位侵染能力强，材料范围广，转化率高，转化子稳定等优势，自借助农杆菌获得首例转基因烟草［2］后，农杆菌介导遗传转化技术便一直备受科研人员的关注。而单子叶植物薄壁细胞缺乏分化能力，因此，单子叶植物的愈伤组织并不能作为农杆菌的宿主，难以转化，在早期农杆菌介导的单子叶植物基因转化中，成功转化的实例很少，所以人们普遍认为基于农杆菌的方法不适合于禾谷类和单子叶植物，但随着对转化机制的深入理解，农杆菌转化法已然成为越来越多科研工作者选择的主要途径。

1 农杆菌介导遗传转化的原理

农杆菌是一种革兰氏阴性菌，广泛分布于土壤。20世纪初，其原理逐渐被人熟知，即自然状态下可以在大部分的双子叶植物的伤口处成功侵染，引起冠瘿瘤的为根癌农杆菌，产生毛状根的则为发根农杆菌［3］。转化机制为利用Ti或Ri质粒，将一段DNA片段通过感染植株的伤口，传入到宿主细胞中，然后通过减数分裂，将其传递到下一代［4］。因此，可以通过在T-DNA区域内插入目标基因加以改造，借助该区域的可转移性，利用农杆菌的侵染，将基因导入到植物中，使其与植物细胞结合，进而利用细胞与组织培养技术获得转基因植株。

2 农杆菌转化典型单子叶植物的研究进展

1984年，HERNALSTEENS等［5］首次成功将根癌农杆菌应用于单子叶植物石刁柏领域，为农杆菌应用于单子叶植物的转化研究提供了理论依据，为单子叶植物的遗传改良开辟了新的途径。近年来，利用农杆菌介导的方法，已成功地应用于禾本科领域，并取得了较大的进展。

2.1 小麦

小麦是世界上最重要的谷类和植物蛋白来源。WOOLSTON等［6］尽管经过多年研究尚未获得转基因植株，但却通过1988年的感染试验，证实了农杆菌对小麦细胞的可转化性。1997年，CHENG等［7］将由35S启动子、HSP70内含子构成的农杆菌载体插入到小麦中，并成功地得到了全球首个由农杆菌介导转化的小麦，尽管最终转化效率还比较低，但农杆菌转化在小麦上的应用却向前迈出了最初的一大步。之后，XIA等［8］报道了农杆菌介导的小麦抗性愈伤组织的诱导效应，并在此基础上产生了再生植株。此后，随着研究的不断深入，已有越来越多的人成功地转化了小麦，HESS等［9］将农杆菌注射到花期小麦穗的小穗上，发芽后获得抗卡那霉素的植株，因此证明nptⅡ基因可以在小麦中稳定遗传。郭丽等［10］以小麦成熟胚为受体，获得了3株PCR分析结果为阳性的再生植株，并构建了相应的遗传转化系统。目前，通过选择标记和报告基因构建的转化系统迈向了优质基因的应用，转化的途径和条件也得到了进一步的改善。张月婷等［11］利用华麦13和扬麦158的胚胎作为受体材料，利用农杆菌介导技术，将ACE-D2基因导入到小麦中，使小麦的遗传体系不断扩大。闫栋［12］运用农杆菌介导法将含CL5527基因的重组质粒导入到愈伤组织中，进一步研究和优化影响基因转化效果的因素，确定了适宜的遗传转化条件。SINGH等［13］借助农杆菌采用无需组织培养的花喷雾转化法，对3个面包小麦基因型进行花转化，发现在Bobwhite和HD2967基因型中发生转化，且转化效率高，证明了花喷雾转化法在转基因面包小麦改良中具有极大的优势和潜能。

2.2 玉米

玉米是我国重要的粮食、饲料作物，也是一种具有代表性的单子叶模式作物。1996年，ISHIDA等［14］利用农杆菌LBA4404对A188玉米自交系的幼胚进行了转化，得到了首个经此技术转化的玉米，并进一步验证了该技术在玉米中应用的可行性，成为玉米遗传转化研究的坚实理论基础。闫慧萍等［15］借助根癌农杆菌茎尖转化技术发现，转入2种外源基因的玉米植株在干旱胁迫下丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量会明显下降，即外源基因的转入对玉米的抗旱性具有明显的影响。于彩虹等［16］借助农杆菌介导技术将构建的RNAi植物表达载体导入玉米幼胚Z31，获得20株转基因玉米T0代植株，杂交授粉后得到T1代种子，T1代植株都表现为雄性不育，而且与野生型对照植株之间没有其他形态差异，从而得到完全雄性不育的植株，提高了杂交种的纯度。韩平安等［17］借助农杆菌介导法对H99玉米自交系幼胚进行单因素试验研究，得出最佳GUS表达率下的胚大小、农杆菌菌液浓度和培养时间，培育出抗草铵膦的植株。LIU等［18］利用未成熟胚进行农杆菌感染，通过对基因型、共培养条件、筛选浓度及分化培养基各物质浓度进行研究，进一步优化了遗传转化体系，确定了最高诱导率的基因型、最佳的共培养方法以及分化培养基中物质浓度的最优组合，确定了玉米遗传转化的最佳条件。李海霞等［19］以2个不同品种玉米杂交种的胚性愈伤组织为材料，对不同浓度的抗菌素、侵染液类型及侵染时间等条件进行了改进，得到优质的抗性愈伤组织。

2.3 水稻

水稻是一种典型的单子叶植物，人们采用农杆菌介导水稻遗传转化已有相当长的历史。水稻的遗传转化已经从最初被认为不可能发展到可行，其应用领域已扩大到频率的改良，从低频转化逐步优化到高频转化。在此基础上，水稻的遗传转化技术问题取得了重大突破，目前已成功开展了大量优质外源基因向水稻的遗传转化［20］。

1993年首次报道了由农杆菌介导的粳稻胚胎遗传转化的个案［21］。1994年，HIEI等［22］在农杆菌介导的水稻转化方面取得了突破，利用改进的农杆菌介导技术，将转基因效率提高至28.6%，从分子层面上证实该基因已经插入到水稻基因组中，且能够稳定地进行遗传并构建了水稻转化系统。RASHID等［23］应用农杆菌介导技术进行了籼稻的转基因，为推广该技术应用于籼稻打下了良好的基础。LIN等［24］应用穿孔法，成功实现了农杆菌介导的粳稻转化，该方法不需诱导愈伤组织，因此转化速度快。高璐等［25］发现，利用2，4-D诱导水稻的成熟种子，7 d后的愈伤组织与农杆菌共转化的效果最好，抗性愈伤的最佳选择时间为14～28 d。崔永祯等［26］利用农杆菌介导技术，从高山离子芥中提取低温诱导基因，并将其转入水稻愈伤组织中，从而选育出耐冷性优良水稻新品种。XU等［27］改良农杆菌介导的水稻转化方法，为水稻杂交制种提供了优良的遗传去雄手段。王慧杰［28］以粳稻品种日本晴，籼稻品种明恢86、9311作为遗传转化材料，探究了不同筛选标记基因、不同培养条件、2个胚形态建成基因和三元载体系统对水稻遗传转化效率的影响，并建立了一种用于水稻遗传转化的三元载体系统。结果表明，三元载体系统引入额外的毒力基因Vir，提高了农杆菌侵染效率，且相比于双元载体，三元载体有效提高了明恢86的遗传转化效率。殷敏［29］对脱落酸浓度、共培养时间等不同条件进行优化，建立了水稻转化体系。

3 影响单子叶植物遗传转化效率的因素

农杆菌通过5个步骤将所携带的外源基因导入到植物中：（1）土壤中农杆菌与植物敏感细胞间的相互作用及吸附；（2）激活土壤农杆菌的毒性区；（3）TDNA的切割和T复合物的生成；（4）T复合物借助土壤农杆菌通过植物细胞膜进入植物细胞；（5）T-DNA整合到植物染色体上。农杆菌介导的单子叶植物的遗传转化可大概总结为：农杆菌对单子叶植物细胞的吸附；农杆菌产生毒性以造成对植物细胞的侵染；最后，T-DNA成功进入植物细胞并顺利整合［30］。

3.1 农杆菌的侵染能力

农杆菌和植物之间的互作是转化的第1步，因此，筛选出高感染率的菌株是成功的关键。在农杆菌的侵染体系中，菌种与载体的正确选择会极大影响转化效率。不同的菌种其宿主范围也各不相同，因此，即便是同一宿主，选择不同的菌种进行侵染，其转化效率也会有所不同。如易自立等［31］用EHA105、LBA4404和AGL1侵染水稻愈伤组织时发现，3种农杆菌对愈伤组织的转化能力存在一定差异，其中EHA105的侵染转化能力最好。蒋云等［32］用2种不同的农杆菌菌系感染小麦，认为利用C58C1菌株的抗性愈伤组织分化率更高，从而优选出感染力强的菌株。

3.2 Ti质粒毒性区的激活

只有VirA-VirG二元调节系统活化才会使农杆菌中的Ti质粒毒性区发挥作用。首先，VirA蛋白作为受体与乙酰丁香酮（AS）等酚类物质的信号分子结合，将VirG蛋白磷酸化而被激活，随后活化的VirG蛋白与其他毒性区域的启动子结合，起始毒性区的转录过程［30］。但是部分单子叶植物遭受外部环境刺激损伤时，细胞会出现木质化、硬化，酚类物质的产生则被抑制，这也是导致单子叶植物不能作为农杆菌有效宿主的主要因素［33］。但许东晖等［34］在水稻部分时期的叶片抽提液中检测到了酚类黄酮化合物。因此，可以得知，单子叶植物无法进行基因改造的根本原因不在于它缺少信号分子，而在于它仅存在于一定的发育时期中。因此，要合理的选择植物受体，并运用相应的方法进行适当的处理，在内源分子浓度较低的情况下通过外源调节方法来提高农杆菌的侵染能力。在对很多转基因单子叶植物进行研究时，往往把AS等信号分子作为共培养过程中重要且必不可少的信号分子。

3.3 单子叶植物的基因型

在农杆菌介导技术的转化过程中，基因环境和受体本身状态的影响也很大。当T复合物进入植物细胞后，植物细胞本身的敏感性便成为限制农杆菌发挥作用的重要因素。不同类型的组织和细胞的敏感程度存在差异，所以选择合适的单子叶植物是实现转化的先决条件。1986年，ABE等［35］经过对66个粳稻、籼稻品种组织培养后得出，不同品种的培养力差异明显。粳稻一般具有较高转化率和成功率，而籼稻愈伤诱导和再生能力相对较弱，其转化率通常不超过10%。郭志江等［36］检测了68个小麦品种成熟胚的GUS基因表达，并对部分品种的幼胚进行PCR检测，筛选出了优良的农杆菌侵染敏感型受体材料。李朝炜等［37］借助农杆菌对石4185和科麦一号2个小麦品种的成熟胚进行转化，经过对GUS表达率的统计发现，用LBA4404菌株进行侵染时，转化率相差近15%。AADEL等［38］研究发现，不同基因型的小麦成熟胚的转化结果各不相同，Amal和Rajae基因型的转基因植株最多。

3.4 其他因素

农杆菌导入受体后，再生系统还需要有合适的培养基来进行移植，否则同样难以实现成功转化。在组织培养过程中，为了促进细胞分裂、诱导愈伤组织和生根，通常会向培养基中加入一定的植物生长调节剂，有利于细胞分裂，活跃培养基，促进转化。彭亚博等［39］发现，2，4-D和Picoram（氨氯吡啶酸）在愈伤组织的早期预培养阶段具有促进成熟胚诱导的作用。但不同品种对应植物生长调节剂的最适浓度及种类不相同，且成熟胚和幼胚的培养条件也不相同。同时，共培养阶段不同的培养基类型及添加的植物生长调节剂、微量元素与无机离子等成分也会对转化效果产生很大的影响。

4 提高农杆菌转化效率的方法

4.1 添加表面活性剂

目前，国内外广泛使用的表面活性剂有离子型和非离子型2种，非离子型毒性相对较低，对植物的杀伤力较小。表面活性剂的使用能够改善细胞膜的透过性，所以在农杆菌的基因转化中，能够有效地增强其对植株的吸附能力，并加快T-DNA从农杆菌中向植物传递，提高其转化率。王志成等［40］改良了农杆菌转化水稻的方法，结果表明，用表面活性剂0.1%Tween 20溶液可降低细胞表面张力，提高愈伤组织的侵染和转化，使抗性植株再生能力得到提高。CHHABRA等［41］的研究发现，在农杆菌侵染液中加入0.2%Tween 20会显著提高农杆菌对小麦愈伤组织的转化，但超过一定的浓度范围时GUS瞬时表达率便大幅度下降。

4.2 添加抗氧化剂

在农杆菌转化单子叶植物过程中，共培养阶段愈伤组织会出现影响组织分化的褐化现象。这是因为在逆境中，植物细胞内存在大量过氧化物，细胞产生氧化胁迫反应。因此，添加抗氧化剂使细胞内的活性氧成分被有效清除，并能促进组织分化。王秀红等［42］对农杆菌介导转化玉米有关因素进行了研究，愈伤组织诱导率与AgNO3质量浓度呈显著的正相关关系，其中AgNO3质量浓度为5.0 mg/L时诱导率可高达94.3%，与未添加AgNO3相比，胚性愈伤率增加37.2%；此外通过直观观察还发现，AgNO3的添加有效地缓解了褐色物质的分泌，对基质的透明度有一定的持续作用。

4.3 超声波处理

超声波引发产生的高压高温冲击，会使组织表面和细胞膜上形成大量的微小伤口，加速农杆菌对植物的侵染，提高转化效率。王旭明等［43］对已经萌发的小麦种子进行超声波处理一段时间后，经农杆菌侵染处理，使之达到结实状态，并用卡那霉素对成熟种子进行抗性筛选，PCR分析结果表明，产生的植株均为抗性后代，而GUS染色结果表明，未经超声波处理的种子，没有发生转化。然而超声波产生的热化作用不可避免地损伤植物，因此，超声波处理的时间和强度要适宜。

4.4 共培养过程中干燥处理

在农杆菌感染后，农杆菌的存活和再生能力会受植物细胞生理状态等因素的影响。适当的干燥处理可以促进组织水分的流失，提高渗透势，增强农杆菌的吸附作用和T-DNA的转移，促进细胞的分裂，使愈伤组织的生长分化能力增强。CHENG等［7］首次在滤纸上将小麦幼胚与农杆菌共培养，发现干燥共培养处理对T-DNA转移和细胞的恢复再生有明显的促进作用。共培养后所有幼胚全部存活并快速生长，而非干燥对照组的幼胚存活率只有60%～80%，且恢复生长缓慢。另外，干燥条件下农杆菌的过度生长受到明显抑制，其数量是对照组的25%左右。丁莉萍等［44］在滤纸上共培养小麦成熟胚愈伤组织与农杆菌，GUS瞬时表达率可高达90%，表明干燥条件下的愈伤中的细菌数量少，有利于抑制后续农杆菌的培养和受体组织的再生，有效地促进转化。彭亚博等［39］利用无菌滤纸进行干燥共培养后发现，预培养时间较短时能显著提高愈伤分化率，经GUS染色发现干燥处理出现蓝斑，而未干燥处理无染色现象。

5 小结与展望

农杆菌介导法在生物监测与解毒、提高作物产量、提高作物营养价值等方面发挥着至关重要的作用。如今农杆菌介导单子叶植物遗传转化已在许多领域取得了长足的发展。近几年来在小麦、玉米、水稻等作物领域，通过改良一些单子叶植物的相关基因，其品质和产量大大提高。但是与农杆菌技术在双子叶植物的应用相比，目前还面临着许多问题，如转化范围窄、转化效率低、感受态细胞稀少、外源基因表达量低等［33］。因此，今后农杆菌介导单子叶植物的研究还需进一步加强，尤其是在分子水平对其深入探讨，同时对影响转化率相关因素的主要作用进行更科学完善的分析，从农杆菌侵染植物细胞的原理入手，不断优化转化方法，逐渐扩大遗传转化的范围，得到更优的遗传转化体系。此外，无选择标记基因的转基因植株生产也是如今亟待解决的关键问题。