新疆北疆部分规模化牧场犊牛巴氏杆菌病调查

张 欢，勾耀鹏，胡朝辉，王晨豫，王 亮，齐亚银★

（1.石河子大学动物科技学院 832003；2.新疆泰昆集团有限责任公司 831100；3.新疆天润乳业股份有限公司 830000）

犊牛健康成长严重者影响牧场的发展情况。新生犊牛容易患消化道疾病和呼吸道疾病，而呼吸道疾病包括病毒病和细菌病、病毒病有牛传染性鼻气管炎、牛副流感3型、牛呼吸道合胞体等。而细菌病包括巴氏杆菌、曼氏杆菌、肺炎链球菌等[1,2]。

牛巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种败血性传染病。急性经过主要以高热、肺炎或急性胃肠炎和内脏广泛出血为主要特征，呈败血症和出血性炎症，故称牛出血性败血病，简称：牛出败[3-5]。临床上主要表现为三种型（败血症型（牛出败）、水肿型、肺炎型）。带菌动物是主要的传染源，病原体存在鼻咽黏膜和扁桃体中（上呼吸道），通过被污染的饲料、饮水传播[6]。牛巴氏杆菌病属于条件致病菌，是犊牛呼吸道中的常在细菌，环境应激是造成本病暴发的重要因素[7]。通常不发病，一旦新生犊牛免疫力下降，受到外界冷热应激、潮湿阴冷、牛舍简陋、氨气过重、通风不良、运输应激等，极易发病。犊牛感染BVD、IBR后继发感染多杀性巴氏杆菌病的病死率增加[8]。

本文为确定导致新疆北疆地区部分牧场犊牛多杀性巴氏杆菌的感染携带情况，采集犊牛鼻拭子使用特异性knt基因进行PCR检测，为该牧场犊牛防控巴氏杆菌病提供科学的依据。

1 材料

1.1 主要试剂与仪器

DNA提取试剂盒购自天根生物科技有限公司。PCR仪购自赛默飞公司。移液器购自Eppendorf公司。

2 方法

2.1 样品来源

2022年7月无菌采集北疆地区2个规模化牧场3月龄犊牛鼻拭子共计42份。将采集好的鼻拭子棉签放入无菌的1.5mL的EP管中。记录好编号快速放入装有冰袋的采样箱带回实验室。

2.2 样品DDNA提取

在采集的鼻拭子1.5mLEP管中加入600 μLPBS，混匀，在-80℃反复冻融三次。DNA提取使用组织基因组DNA提取试剂盒，按照说明书提取鼻拭子DNA。具体步骤按照试剂盒说明书进行。

2.3 引物合成

根据参考文献[9]中巴氏杆菌特异性基因kmt引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成，见表1。

表1 巴氏杆菌kmt 特异性引物序列

2.4 PCR扩增

本实验以提取的总DNA为PCR反应体系中的模板。反应体系如下表2。

表2 巴氏杆菌kmt特异性引物反应体系

使用PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳试验。使用琼脂糖凝胶成像仪观察结果。

3 结果与分析

3.1 巴氏杆菌PCR调查结果

北疆部分地区两个规模化牧场巴氏杆菌PCR调查结果：牧场一犊牛巴氏杆菌阳性率为23.8%（5/21）。牧场二犊牛巴氏杆菌阳性率为19.05%（4/21）。犊牛巴氏杆菌病总阳性率为21.42%（9/42）。结果见图1，表3。两个牧场犊牛均有不同程度的巴氏杆菌感染。且感染率较高，当犊牛免疫力下降时，牧场如不进行提前防控措施，可能会造成不可估量的损失。

表3 巴氏杆菌kmt特异性引物检测结果

图1 巴氏杆菌kmt特异性引物扩增结果电泳图M:Marker;1-21鼻拭子样品总DNA；

4 讨论

规模化牧场中，犊牛是牧场发展的基础。而巴氏杆菌病是新生犊牛极易发生的疾病，饲养不当，环境中携带致病菌，犊牛应激导致个体免疫力下降从而发病。应激包括热应激，冷应激等。夏季防暑冬季保暖，落实新生犊牛初乳饲喂，加强牧场饲养管理，避免犊牛腹泻给牧场带来不必要的损失[10]。本试验调查结果表明调查的牧场一犊牛巴氏杆菌阳性率为23.8%（5/21）。牧场二犊牛巴氏杆菌阳性率为19.05%（4/21）。犊牛巴氏杆菌病总阳性率为21.42%（9/42）。新疆北疆地区牧场犊牛均有不同程度的巴氏杆菌病的感染情况。巴氏杆菌作为牛呼吸道常在细菌，而诱发该细菌的条件较多，临床上根据临床症状鉴别较为困难，难与溶血性曼氏杆菌、支原体等疾病进行鉴别诊断，实验室鉴别方法较多。通常以病毒病发病导致继发感染，以混合感染的情况出现较为常见[11,12]。

巴氏杆菌的感染机制分为内源性感染和外源性感染，因此防控该细菌的主要两个措施就是消除传染源，切断传播途径[13,14]。内源性感染：当各种原因导致牛的抵抗力下降时，寄生于呼吸道、消化道黏膜的多杀性巴氏杆菌趁虚而入，经淋巴液进入血液发生感染。防控内源性感染这情况主要是在于提高犊牛自身的免疫力，加强饲养管理，减少各种应激，避免犊牛抵抗力下降过低，继而感染发病。外源性感染：多杀性巴氏杆菌能通过受损的呼吸道、消化道以及皮肤感染。防控该途径主要是消灭传染源，加大对饲养环境的消毒，犊牛接种疫苗后伤口进行消毒。避免犊牛伤口接触继而发生菌血症等。

新生犊牛的免疫力较差，而巴氏杆菌可通过病菌可通过空气飞沫、饮水、饲草等传播，传播途径广，群体发病率高，淘汰率、致死率高，临床上一旦发现疑似巴氏杆菌感染，临床症状表现明显的立即单独隔离饲养，查明病因，治疗痊愈后再返回原饲养圈舍。巴氏杆菌易与其他呼吸道病原形成混合感染导致肺炎。对牛群危害极大[15]。

牧场治疗该病主要以提高犊牛的免疫力结合使用巴氏杆菌敏感性药物进行治疗为该病的主要治疗措施。具体为措施为新生犊牛做好饲喂初乳，饲喂时添加中药制品黄芪多糖有较好的表现。使用泰拉霉素进行预防，取得了较好的临床效果，3月龄以内的犊牛呼吸道疾病发病率显著下降。3月龄以上的犊牛建议使用巴氏杆菌疫苗进行免疫。现阶段巴氏杆菌疫苗已经非常成熟，3月龄以上犊牛首免一次，21d后加强免疫一次可有效防控巴氏杆菌病的出现。现阶段因抗生素滥用导致细菌的耐药性逐年增加，耐药菌株增多，巴氏杆菌耐药性也有不同程度的增强[16]。使用提高犊牛免疫力和疫苗免疫成为该疾病的主要防控措施。