不同基础培养基及其添加成分对鸡球虫E.tenella细胞培养的影响研究

李艳艳，白继超，徐中清

（北京市大兴区生物医药基地中国兽药药品监察所 102699）

1 概述

鸡球虫病是一种特殊的鸡肠道寄生虫。选择合适的球虫繁殖培养基及其添加成分是球虫体外培养的关键，也是建立球虫体外筛选模型不可或缺的一步[1]。本文报道了不同培养基的重复比较以及在培养基中添加的成分对E.tenella的影响。体外细胞培养在球虫病的分子免疫学、生物化学、细胞培养及耐药性研究中起着重要作用，还可以加强禽类球虫病预防，促进球虫疫苗的发展[2]。在体外培养过程中，影响球虫生长的因素包括环境温度、细胞系的选择和培养基。本研究比较了不同基础培养基及其添加成分对鸡球虫E.tenella细胞培养的影响。

影响球虫病体外培养成功的因素很多，其中培养基及其组成是影响球虫病体外培养成功的重要因素之一[3]。最初的实验主要集中在培养基的选择上，然后逐渐对其有效成分进行了研究。EAGLESMEM和EAG'LESBME是最早被认为是营养培养基的培养基，含有水解乳蛋白和培养基19的HBSS也被用来培养E.etenlla。此后，rpmi1640介质得到了广泛的应用[4]。然而，经过反复比较，我们发现MEM-A培养的E.tenella能显著增加第二代分裂体和卵囊的数量。通过对两种培养基成分的比较，发现a-mem中含有核糖核苷和脱氧核糖核苷，因此它的含量是E.tenella体外培养的关键因素之一。

2 方法

2.1 子孢子纯化

2.1.1 卵囊破壁

卵囊计数后，3000r/min，离心10min去除上清液，将沉淀物加入组织研磨机，在冰水中研磨。连续显微镜观察，直到90%左右的球虫病卵囊破裂，3000r/min，离心10min，丢弃上清液，4°备用。

2.1.2 子孢子脱囊

将含孢子囊的溶液分别加入A、B、C、D四种不同剂型的解囊溶液中，40℃水浴，纯化消毒后，在解囊过程中消化时进行显微镜检查。在显微镜下连续观察脱囊状态，持续半小时后停止。

2.1.3 子孢子的纯化

制备20%、30%、65%、70%、75%和80%蔗糖溶液。在不同的离心管中加入65%、70%、75%和80%的蔗糖，然后用滴管依次向离心管中加入20%、30%的蔗糖溶液并进行标记。并且与含有带子孢子的脱囊液混合，1500r/min，离心十分钟，在两种浓度溶液之间会显示出白色条带，将其吸取。用3000r/min的pbs溶液离心洗涤蔗糖溶液15min，根据解冻后纯化孢子数与孢子数的比值计算回收率。

2.1.4 子孢子活性检测

用不同的脱囊液用相同的方法纯化子孢子后，用PBS将纯化的孢子定量至2mL，吸收1滴小孢子液，并向玻片中加入2滴伊红染料。2min后显微镜下观察，染色计数后算出未染色的子孢子数在总子孢子数的占比，并记录存活率。

2.2 鸡胚成纤维细胞的制备

2.2.1 取9～11日龄鸡胚，取出鸡胚体，置于灭菌板中，取出内脏、头部和四肢，洗涤PBS两次。

2.2.2 将胚胎转移到小烧杯中，完全切割，冲洗PBS两次，然后将PBS吸入。

2.2.3 加入2mL 0.25%胰蛋白酶，在37℃下消化约15min。

2.2.4 轻轻吸取胰蛋白酶，冲洗PBS两次，吸取PBS。

2.2.5加入少量生长液，轻轻吹气过滤上清液；吹开其余的组织，并用生长液过滤。

2.2.6 将滤过的细胞悬液稀释10倍，计数，调整细胞密度至40～60万/mL。

2.2.7 加50mL细胞培养瓶培养。37℃培养，24～28h形成单层致密层。

2.3 鸡肾细胞原代培养

2.3.1 在无菌环境中采集10d龄左右的雏鸡肾脏。

2.3.2 将肾脏转移到一个小烧杯中，切成小块，洗涤两次，然后吸取PBS。

2.3.3 加入5倍体积的0.25%胰蛋白酶，在37℃条件下消化约半小时。

2.3.4 加入少量生长液，轻轻吹气过滤上清液；其余的组织被吹走，并用生长液过滤。

2.3.5将滤过的细胞悬液稀释10倍，计数，调整细胞密度至40～60万/mL。

2.3.6加50mL细胞培养瓶培养。

2.3.7 37℃培养，24～28h形成单层致密层。

2.4 传代细胞系的细胞培养

2.4.1冷冻保存细胞的复苏：在液氮中冷冻保存的MDBK细胞在37℃的水浴中在1min内迅速溶解。加入细胞瓶，加入含有血清和双抗体的培养基，37℃，5% CO2，12h，倒入培养基，用新的含有双抗体的培养基代替。

2.4.2细胞传代：细胞瓶底涂布80%后，倒入培养基，D-Hank洗涤3次，加入少量胰蛋白酶，37℃，5% CO2消化3min，显微镜下细胞呈圆形后，加入培养基，吹干均匀，然后放入37℃，5% CO2培养。

2.5用rp mL 64测定不同血清的培养效果比较了鸡血清和胎牛血清中铝的含量。实验分为A组鸡血清组；B组胎牛血清组：用10个培养细胞制备胎牛血清，用5%胎牛血清接种种子。重复测试三次。

2.6胰岛素最佳浓度试验

试验分为3组0.05、0.05、0.5g/mL培养基，基础培养基为rpml640，细胞培养过程中加入10%小牛血清和5%鸡血清，观察E.tenella培养的效果。观察不同浓度胰岛素对E.tenella的影响。

2.7 介质成分对比试验

以rpml640和a-mem为基础培养基，比较不同基础培养基的效果。重复测试三次。

2.8 效果判定指标

2.8.1 细胞生长：接种前、接种后2、4、6d倒置显微镜观察细胞覆盖面积10次，每组30个视野。

2.8.2 第二代血吸虫计数：接种后10x4.5d倒置显微镜下计算第二代血吸虫计数，每组30个视野。

2.8.3 卵囊数：取种子8d后，用0.05%d ta和0.3%胰蛋白酶处理消化细胞层。收集卵囊，用mcmas和r型计算器计算卵囊数。

3 结果

3.1 不同基质中细胞生长的比较

以a-mem和RPMl640为基本培养基，对鸡肾原代细胞进行培养。它的细胞覆盖率见表1。从表1可以看出，A-MEM组在接种前和接种后2、4和6d的细胞覆盖率均高于RPML640 组。

表1 两种培养基对鸡肾原代细胞生长的影响

3.2 不同基础培养基对Etenla卵囊数的影响

第2代淋巴细胞接种后4.5d计数，8d收集卵囊数。结果见表2。如表2所示，平均每场第二代淋巴瘤数为N和17.5，卵囊数为65和91个/孔，高于A-MEM。

表2 两种培养基对第二代血吸虫和卵囊形成的影响

3.3 培养基中添加不同成分的入侵率

入侵率（%） 肌苷 水解乳蛋白 叶酸 全培养基 空白PH=7 14.54 13.43 9.61 9.23 3.51 PH=7.6 13.51 11.21 9.65 9.45 2.41

4 讨论

在E.tenella艾美耳球菌的体外培养技术中，MDBK是一个很好的上皮细胞系[5]，但布氏E.tenella在MDBK细胞中发育不好[6-7]，微小隐孢子虫在MDBK中不发育。BHK广泛应用于AMEL培养，被认为优于鸡肾和火鸡肾细胞。楚德军认为BHK、MDBK和RK-13适合球虫的生长，更适合E.tenella艾美球虫的体外培养[8]。有证据表明，mdbk和hep2细胞更适合弓形虫、rk13、bhk、rdavero和cer的体外培养[9]。HCT-8细胞被认为是最适合体外培养微小隐孢子虫的细胞，但有些人在微小隐孢子虫侵入后比MDCK、MA-104、HEP-2和VERO细胞更容易受到感染，其中微小隐孢子虫不能有性繁殖，VERO细胞侵入性最小，不能形成滋养层[10]。结果还表明，小隐孢子虫体外培养的绒毛细胞获得的卵囊更具感染性，更适合小隐孢子虫体外培养[11]。温度对球虫的生长也有很大的影响。以LMH、BHK、MDBK、HCT-8、VERO、CRFK、PK-15、RK-13和IEC-6为载体时，41℃更适合球虫生长，以CaCO-2和MDCK为载体时，37℃更适合球虫生长。更适合球虫生长。因为球虫自然宿主的体温是41℃。研究表明，弓形虫在37℃和室温下的体外培养对弓形虫感染率有显著影响，29℃的体外培养可产生较多的速殖子。但是温度对葡萄孢菌体外培养的影响不大，在细胞类型中起着重要作用。然而，艾美耳球菌体外培养细胞毒的研究却未见报道。实验结果表明，37℃下强毒艾美球虫的侵袭时间明显长于41℃，这可能是由于体温为41℃所致。虽然37℃更适合细胞生长，但如果需要进行毒力艾美耳球菌的体外培养试验，则认为孢子侵染和随后的培养过程中的温度控制更接近自然状态。

培养基也是影响球虫生长的重要因素。结果表明，5%水解乳蛋白的MEM细胞培养基是一种适合E.tenella艾美耳球菌体外培养的培养体系。将腺苷或肌苷加入THP-1培养72h的微小隐孢子虫培养基中，可以增加卵囊的产生，而在MDBK细胞中添加肌苷24h也可以增加卵囊的产生。在培养基中加入叶酸可提高球虫的表达。此外，ph值也会影响球虫的产量。一般认为pH7.4对球虫生长最有利。血清含量对弓状细胞增殖有明显影响。实验结果表明，肌苷能提高孢子的侵染率，且比其他组分更有效。

血清是球虫培养不可缺少的成分。经过长时间的探索，我们发现鸡血清在培养嫩链球菌中起着重要作用。与牛血清和猪血清相比，鸡血清能促进鸡肾细胞的生长和有丝分裂原的形成。实验表明，鸡血清有利于卵泡的形成，其作用机制可能与鸡血清的同源性有关。

维生素曾经被认为是球虫培养的重要成分。苏丁泽阳， 高阳[12]证明，生物素、叶酸、肌醇、盐酸硫胺素、维生素E、维生素K、对氨基苯甲酸、维生素BX和维生素E有利于E.tenella第二代分裂阶段和卵泡形成。然而，王黎霞等[13]发现这些维生素不是E.tenella生长所必需的E.物质。氨基酸中的精氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸和色氨酸被认为是e培养物，E.tenella的有用物质由于缺乏在培养基中，对培养结果有很大的影响。蒋保余[14]证实了这一点。尽管以前对培养基的组成进行了大量的研究，但E.tenella的栽培工作未能突破，卵囊产量没有提高，检测结果不稳定，影响细胞培养的正常化。为了解决卵囊产生的问题，我们研究了胰岛素对E.tenella细胞的影响。E.tenella细胞的培养表明，它不仅能促进鸡原代肾细胞的生长，而且能促进第二代E.tenella淋巴细胞的生长和增加卵泡数量。以前的培养E.E.tenella的结果是每平方厘米只有200个卵囊。结果表明，在胰岛素培养基中加入0.05μg/mL，培养基中卵泡数稳定且显著增加。电流实验结果达到700个单位。生理学研究表明，胰岛素在调节糖、脂肪和蛋白质代谢中起着非常复杂的作用。胰岛素调节的一般方向是促进合成代谢和抑制合成代谢。结果表明，胰岛素对鸡肾细胞和E.tenella芽孢杆菌的作用相似，但其作用机制有待进一步研究。

鸡肾原代细胞和对虾肾原代细胞的培养，细胞生长迅速，活力旺盛，第二代血吸虫数量高于小牛血清。然而，细胞生长迅速，细胞团消失，如果继续使用胎牛血清，最终培养的卵囊数量减少，这与小跑团的减少有关。在E.tenella细胞培养中，建议用小牛血清和鸡血清提高卵囊产量。

整体而言，作者认为在体外培养过程中，当vero细胞在40℃条件下使用时，在培养基中加入叶酸更有利于实验的准确性。