纳米材料修复镉污染土壤环境效应与风险评价研究

孙伟毅 李思诺

（盐城市东台生态环境局，江苏东台 224200）

1 引言

近年来，随着纳米科技快速发展，纳米材料在环境污染防治中的应用潜力受到广泛关注。当前，国内外对应用零价nZVI、纳米ZnO、纳米TiO2等去除水体和污泥中的金属离子，降解土壤有机污染物研究的报道甚多，对应用纳米材料修复土壤重金属污染的研究起步较晚，当前主要停留在实验室研究阶段［1］。

与nZVI 类似，SeNPs、硒硅溶胶具有比表面积大及反应活性强等性质，理论上能够吸附并催化土壤重金属离子还原反应，降低重金属离子的迁移、转化及其生物有效性，削减重金属离子毒性。本文在借鉴他人研究成果基础上，合成稳定的nZVI、SeNPs、硒硅溶胶，结合工业化石墨烯材料，探讨纳米材料进入Cd 污染土壤后对Cd2+有效态变化的影响，同时分析蚯蚓相关生理生化指标变化，以此评价土壤修复后的环境效应和生态风险［2］，为应用纳米材料修复土壤重金属污染提供参考。

2 材料与方法

2.1 纳米材料合成与表征

nZVI 的合成：取少量FeCl3溶于80%无水乙醇，加入0.5% CMC（m/V）和0.1 mL TEOS，通氮气，搅拌15 min，滴加4 mL 5.17 mol/L Na4BH 溶液，搅拌1 h，定容至200 mL。TEM 检测结果表明，nZVI 粒径小于10 nm；用ICP－MS 测定其铁浓度为1.5 mg/mL。

应用载体/模板法制备SeNPs 反应体系：2 mmol/L亚硒酸钠、6 mmol/L 还原性谷胱甘肽、1.25 mg/mL 壳寡糖，40 ℃搅拌40 min，生成硒纳米溶胶，定容至500 mL。TEM 检测结果表明，SeNPs 粒径为50～80 nm；用ICP－MS 测定其硒浓度为0.272 mg/mL。

硒硅溶胶合成：取250 mL 无水乙醇、10 mL 浓氨水、5 mL 去离子水，40 ℃搅拌3 h；缓慢加入0.15 g Na2SeO3、0.5 g 壳寡糖，40 ℃磁力搅拌30 min；加入50 mL 0.3%（m/V）GSH，搅拌20 min；加入5 mL TEOS，40 ℃磁力搅拌1 h，定容至500 mL，4 ℃保存。TEM 检测结果表明，SeNPs 粒径为40～50 nm；用ICP－MS 测定其硒浓度为0.125 mg/mL，硅浓度为0.937 mg/mL。

石墨烯为工业级多层石墨烯材料，TEM 检测结果表明其为片层结构。

2.2 复合污染土壤制备与蚯蚓暴露培养

对照组土壤仅喷洒CdCl2溶液，Cd 浓度3 mg/kg；分别取nZVI、SeNPs、硒硅溶胶3 mL，定容至300 mL，超声处理后喷洒至3 mg/kg Cd 污染土壤，制备成nZVI＋Cd、SeNPs＋Cd、硒硅溶胶＋Cd 复合污染土壤。取0.125 g 石墨烯，溶于280 mL 去离子水，超声3 h，定容至300 mL，喷洒至3 mg/kg Cd 污染土壤，制备石墨烯＋Cd 复合污染土壤。室内老化15 d 置入蚯蚓，在21～23 ℃、65%相对湿度环境下暴露培养15 d，检测蚯蚓生理生化指标，用ICP－OES 测定土壤有效态Cd 变化。

2.3 土壤有效性Cd 浓度测定

取5.00 g 经2 mm 筛的风干土壤样品，置入100 mL锥 形 瓶。加 入25.0 mL 10 mmol/L Na2EDTA 溶 液（pH＝8.0），室温下以180 次/min 振荡2 h；3 000 r/min条件下离心20 min，上清液经0.45 μm 滤膜过滤，用ICP－OES 测定Cd 浓度。

2.4 蚯蚓抗氧化酶与内肽酶同工酶图谱分析

蚯蚓清肠24 h 后，制备粗酶液，上清液－80 ℃保存备用。可溶性蛋白含量采用Bradford 方法（考马斯亮蓝法）测定。

应 用Bio－Rad Mini－PROTEAN 电 泳 系 统 和Native－PAGE 电泳系统分离同工酶，电泳缓冲液含25 mmol/L Tris，192 mmol/L 甘氨酸（pH＝8.3），4 ℃条件下电泳。SOD，CAT，APX，POD 同工酶电泳的分离胶10%，积层胶5%；CAT 分离胶6%，积层胶4%；分别应用相应显色液显色，数码相机摄像。

内肽酶（EP）同工酶试验，SDS－PAGE 电泳分离内肽酶同工酶，8%分离胶，5%积层胶，4 ℃条件下电泳；电泳结束后，将凝胶浸没0.1 mol/L 冰醋酸—醋酸钠缓冲液（pH＝4.5），37 ℃恒温水浴3 h，将凝胶移至250 mmol/L Tris－HCl（pH＝7.5），36 ℃恒温孵育2 h，再将凝胶移至显色液中，染色2 h，用40%甲醇（V/V）/10%冰乙酸（V/V）脱色，至蓝色背景下白色带型出现［3］。

2.5 蛋白酶活性测定

蛋白酶活性测定方案反应体系：50 mmol/L Tris－HCl（pH＝7.5），0.08%（m/V）偶氮酪蛋白，适量粗酶液；37 ℃条件下分别孵育1，3 h，用10%（m/V）三氯乙酸（TCA）终止反应，参照管首先添加TCA，再加入粗酶液。反应结束后，4 000 g 条件下离心10 min，测定上清液OD366nm值，每毫克酶蛋白每分钟升高0.01 作为1 个酶活力单位（U）。

2.6 蛋白羰基化产物免疫印迹

蛋白羰基化产物的免疫印迹，50 μL 粗酶液与50 μL10%（m/V）SDS，100 μL 20 mmol/L DNPH/20%（m/V）三氟乙酸（TFA）混合，空白组用100 μL 20%（m/V）TFA 替代20 mmol/L DNPH/20%（m/V）TFA。室温下静置30 min，依次加入100 mL 2 mol/L Tris（pH＝8.0）/30%（V/V）甘油/6%（V/V）β－疏基乙醇、50 μL 1%（m/V）溴酚蓝，混匀后上样，SDS－PAGE 电泳；半干转印后，依次包被一抗和二抗；最后用Supersignal West Femoto Trial Kit 发光试剂盒显色、X 光片曝光显影，数码相机拍摄［4］。

3 结果与分析

3.1 土壤有效态Cd 浓度变化

与对照组比较，nZVI、SeNPs、硒硅溶胶降低土壤Cd 有效性显著；同时发现，工业化石墨烯对土壤Cd有效态未产生明显影响，如图1 所示（ck 为3 mg/kg Cd，a1，b1，c1，d1 分别为nZVI＋3 mg/kg Cd、SeNPs＋3 mg/kg Cd、硒硅溶胶＋3 mg/kg Cd、石墨烯＋3 mg/kg Cd 复合污染土壤；n＝3，p＜0.05）。

图1 4 种纳米材料对处理Cd 污染土壤有效态Cd 浓度的影响

3.2 抗氧化酶同工酶图谱变化

考察4 种纳米材料与Cd 复合污染土壤对蚯蚓蛋白氧化损伤的影响。4 种纳米材料与土壤Cd 复合后，未改变蚯蚓体内SOD，CAT，APX，POD 同工酶带型数量，诱导了其酶活性变化。4 种纳米材料适度提高了SOD，CAT 酶活性。nZVI，SeNPs 对APX 酶活性影响较小，硒硅复合溶胶、石墨烯提高APX 酶活性明显。4 种纳米材料与Cd 复合后均降低了POD 酶活性。

3.3 蛋白基化产物变化

免疫印迹结果表明，nZVI、硒硅溶胶、石墨烯诱导蚯蚓蛋白羰基化产物明显升高。因此，以上3 种纳米材料诱导了蚯蚓蛋白分子氧化损伤。

3.4 蚯蚓蛋白酶活性与内肽酶同工酶变化

4 种纳米材料与土壤Cd 复合后诱导蚯蚓体内蛋白酶活性与内肽酶同工酶活性升高；其中，nZVI、硒硅溶胶与石墨烯提高蛋白酶活性显著，SeNPs 与Cd 复合后未诱导蚯蚓蛋白酶和内肽酶同工酶明显变化。此外，nZVI 和硒硅溶胶还诱导内肽酶同工酶带型数量增加。

4 讨论

4.1 4 种纳米材料修复土壤Cd 污染的环境效应

纳米颗粒进入土壤后易团聚，直接影响其在土壤中的迁移和传递，且在与土壤介质和微生物相互作用过程中，其反应活性受到干扰。以nZVI 为例，国内外通常采用改性、负载、包覆、分散等措施提高其稳定性和传递能力。采用CMC 负载nZVI，应用硅包覆纳米铁颗粒、壳寡糖负载与包埋SeNPs 颗粒、壳寡糖负载硒硅溶胶。结合纳米硅对SeNPs 掩蔽作用，提高了上述纳米颗粒在土壤中的稳定性。试验结果表明，nZVI、SeNPs、硒硅溶胶降低土壤Cd 有效性显著，工业化石墨烯对土壤有效态Cd 影响较小，可能与4种纳米材料对Cd2＋的还原能力有关，其中，nZVI 对土壤Cd2＋还原能力最强，石墨烯最小。

4.2 4 种纳米材料与Cd 复合对土壤生态安全的影响

与对照组相比，nZVI 与Cd 复合后诱导蚯蚓SOD 和CAT 酶活性明显升高，同时，硒硅溶胶和石墨烯诱导APX 明显升高，推测nZVI、硒硅溶胶或石墨烯可能诱导了蚯蚓体内ROS 产生与积累，进而诱导抗氧化酶同工酶活性升高，清除部分ROS 产物，缓解了复合污染引起的蚯蚓组织细胞氧化胁迫。当ROS 大量产生而未及时清除时，ROS 攻击蛋白分子中敏感基团，诱导蛋白羰基化产物产生。氧化损伤蛋白若不及时降解，可能干扰细胞正常代谢功能，甚至导致细胞死亡。

试验结果表明，4 种纳米材料与土壤Cd 作用后，不同程度地诱导了蚯蚓组织蛋白分子氧化损伤，其中nZVI、硒硅溶胶和石墨烯明显诱导了蚯蚓组织蛋白羰基化产物增加，尤其硒硅溶胶最明显，其蛋白毒性最强。

5 结论

通过土壤有效态Cd 浓度与蚯蚓毒理学指标的变化发现，nZVI 和硒硅溶胶虽能显著降低土壤Cd有效性，但同时加剧了复合污染土壤对蚯蚓蛋白的损伤，表明2 种纳米材料加入Cd 污染土壤后加剧了土壤蛋白毒性；SeNPs 既削减土壤Cd 离子有效性，又未明显诱导蚯蚓组织细胞蛋白毒性。因此，SeNPs修复土壤Cd 污染的潜力高于其余3 种纳米材料，具有修复Cd 污染土壤的应用前景。