气相色谱-内标法测定白酒中3种高级脂肪酸乙酯含量

毕荣宇，乔敏莎，卢 君*，唐 平，山其木格，王 丽，王 凡，李长文

（1.贵州国台酒业集团股份有限公司，贵州 遵义 564501；2.天士力控股集团有限公司研究院，天津 300410）

中国白酒作为世界六大蒸馏酒之一，历史悠久，风格独特[1-2]。其主要成分除占98%的乙醇和水外，还含有2%的醇、酸、酯、醛和其他芳香族化合物等微量成分[3-6]。其中含量较高的棕榈酸乙酯（ethyl palmitate，EP）、油酸乙酯（ethyl oleate，EO）和亚油酸乙酯（ethyl linoleate，EL）并称为白酒中的三大高级脂肪酸乙酯[7]。这3种高级脂肪酸乙酯不溶于水，溶于乙醇，沸点高，不易挥发[8-10]。3种高级脂肪酸乙酯是白酒的重要风味物质，它们可以增加酒的厚重感，减少干涩，增强后味[11]。这些物质在酒体中的稳定性与酒精度、在酒精中的溶解度以及环境温度密切相关，相关研究表明，3种高级脂肪酸乙酯的含量在低度酒中超过2 mg/L时，就会造成白酒酒体浑浊，影响白酒质量[12-13]。因此，很多酒类企业为了保障产品的透明度，会严格控制其含量或者在工艺环节直接去除。白酒中3种高级脂肪酸乙酯的准确定量是监管与控制的前提。

目前，3种高级脂肪酸乙酯的检测方法在相关的国家标准和行业标准中都未涉及，文献报道的方法主要有气相色谱法（gas chromatography，GC）[14-16]和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用法。刘奕霏等[7]建立了白酒中3种高级脂肪酸乙酯的气相色谱-质谱联用检测方法，结果表明，该方法可成为白酒真伪鉴定和案件串并溯源工作的一项重要技术手段。左国营等[8]利用GC-MS对白酒中油状物质进行了定性分析，通过对比分析发现，样品中的己酸乙酯、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯含量相对较大，是造成白酒降度浑浊的主要因素。徐军[17]对浓香型枝江白酒香味成分进行研究，结果表明，摘酒度数越低，蒸馏过程中后段酒高级脂肪酸乙酯含量越高。李凯敏[18]采用优化后的顶空固相微萃取条件（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）对特香型原酒样品进行萃取，进行GC-MS分析，结果表明，特香型白酒风味成分中响应值较高的峰均为棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯和油酸乙酯等乙酯类物质，证明了酯香是特香型白酒的主体风味。NIU Y W等[19]采用气相色谱-嗅觉测量法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）和GC-MS对中国茅台酒中的31种酯类香气成分进行了鉴定，采用液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）和HS-SPME两种方法提取后，采用GC-MS对其进行了定量分析，其中棕榈酸乙酯的含量在11.888 0～12.009 0 mg/L之间。MA L H等[20]利用HS-SPME和同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）结合GC-MS和GC-O对致中和五加皮药酒中的风味物质进行了分析，其中棕榈酸乙酯的含量为0.806 1 mg/L。WANG J S等[21]利用现代分离技术和分子感官评价方法揭示了浓香型白酒中的香气化合物，详细介绍了棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯等46种酯类化合物的研究进展。

本研究以乙酸正戊酯为内标物，建立了白酒中棕榈酸乙酯、油酸乙酯和亚油酸乙酯的气相色谱（GC）检测方法，并探究了市售不同香型白酒、不同品牌酱香型白酒中3种高级脂肪酸乙酯的含量分布规律，为定性、定量分析白酒中3种高级脂肪酸乙酯提供准确、有效的检测方法。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与试剂

不同香型白酒酒样（共11种）（编号为酱香型7-2#、浓香型8-5#、清香型7-1#、老白干香型7-3#、芝麻香型8-6#、豉香型7-4#、凤香型8-1#、兼香型8-3#、米香型7-5#、董香型8-2#、馥郁香型8-4#；不同品牌酱香型白酒酒样（共35种）（编号为JT9-1#～JT9-5#、LT12-1#～LT12-5#、GT10-1#～GT10-5#、DT13-1#～DT13-5#、XT14-1#～XT14-5#、MT15-1#～MT15-5#、ZT17-1#～ZT17-5#）：市售。

棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯（纯度均＞97%）、乙醇（色谱纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；乙酸正戊酯（纯度99.5%）：天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

Thermo trace 1310气相色谱（GC）仪（配备AI-1310自动进样器）、Gen Pure xCAD Plus纯水机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ME204T电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Agilent HP-FFAP色谱柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）：安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备

3种高级脂肪酸乙酯和乙酸正戊酯储备液：分别准确称取棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯140.1 mg、133.6 mg、144.8 mg，用体积分数53%乙醇溶液定容至20 mL；乙酸正戊酯称取1.762 9 g，用体积分数53%乙醇溶液定容100 mL。棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯的质量浓度分别为6.935 0 mg/mL，6.546 4 mg/mL，7.002 8 mg/mL；乙酸正戊酯的质量浓度为0.175 4 mg/mL。

3种高级脂肪酸乙酯中间液：分别准确移取3种高级脂肪酸乙酯储备液5 mL至50 mL容量瓶中，用体积分数53%乙醇溶液定容。棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯的质量浓度分别为0.693 5 mg/mL、0.654 6 mg/mL、0.702 3 mg/mL。

3种高级脂肪酸乙酯标准溶液：移取不同体积的中间液（0.05 mL、0.10 mL、0.25 mL、1.00 mL、4.00mL、6.00 mL），用体积分数53%乙醇溶液定容至10 mL，质量浓度分别为0.0030mg/mL、0.0070mg/mL、0.017 0mg/mL、0.070 0 mg/mL、0.2700mg/mL、0.3900mg/mL。

1.3.2 样品前处理

取酒样混匀后放置磨口玻璃瓶内待用。准确量取酒样5.00 mL于10 mL具塞磨口离心管中，加入内标乙酸正戊酯标准溶液50 μL，混匀，供GC分析。

1.3.3 仪器检测条件

色谱条件：色谱柱为Agilent HP-FFAP色谱柱（30 m×0.53 mm×1.0 μm）；进样口温度240 ℃；分流进样，分流比1∶25；分流流量为75.0 mL/min；吹扫流量2.0 mL/min；横流模式；流速为3 mL/min；程序升温为初始柱温37 ℃，保持7 min，以3.5 ℃/min升温至45.0 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升温至80 ℃，保持0 min；再以10 ℃/min升温至100 ℃，保持4 min；再以20 ℃/min升温至180 ℃，保持0 min；再以15 ℃/min升温至200 ℃，保持20 min；载气为氮气（N2）；检测器为氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）；检测器温度为250 ℃；进样量1 μL。

2 结果与分析

2.1 标准品的测定

取一定浓度的3种高级脂肪酸乙酯混合溶液进行气相色谱分析，通过每种高级脂肪酸乙酯的标准样品确定其保留时间结果见图1。

由图1可知，3种高级脂肪酸乙酯均可以检出，乙酸正戊酯（内标）、棕榈酸乙酯（EP）、油酸乙酯（EO）和亚油酸乙酯（EL）的保留时间分别为18.287 min、34.957 min、39.853 min、41.438 min，各物质色谱峰可以达到完全分离（R＞1.5），能实现良好的分离。

图1 3种高级脂肪酸乙酯与乙酸正戊酯的标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of 3 kinds of higher fatty acid ester and n-amyl acetate standard

2.2 方法的线性方程、相关系数、线性范围、检出限与定量限

准确量取100 μL乙酸正戊酯内标溶液加入不同质量浓度的3种高级脂肪酸乙酯标准溶液中，混合均匀。以3种高级脂肪酸乙酯质量浓度（x）为横坐标，3种高级脂肪酸乙酯峰面积与内标乙酸正戊酯峰面积比（y）为纵坐标，绘制标准曲线，利用0.003 0 mg/mL的质量浓度水平为依据，3倍信噪比（S/N=3）计算检出限（limit of detection，LOD），10倍信噪比（S/N=10）计算定量限（limit of quantitation，LOQ），得到3种高级脂肪酸乙酯的标准曲线线性方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限，结果见表1。由表1可知，3种高级脂肪酸乙酯在各自质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（R2）均≥0.999 2。棕榈酸乙酯（EP）、油酸乙酯（EO）、亚油酸乙酯（EL）的检出限分别为0.003 4 mg/mL、0.003 2 mg/mL、0.003 5 mg/mL，定量限分别为0.011 6 mg/mL、0.010 9 mg/mL、0.011 7 mg/mL，本方法具有较低的检出限与定量限，灵敏度能够满足白酒中高级脂肪酸乙酯的检测需求。

表1 3种高级脂肪酸乙酯的线性方程、线性范围、相关系数、检出限与定量限Table 1 Linear equation,linear range,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of 3 kinds of higher fatty acid esters

2.3 加标回收率与精密度试验

准确移取10 mL的酒样，分别按照低、中、高三个水平添加高级脂肪酸乙酯标准溶液，按照样品前处理方法进行处理并测定高级脂肪酸乙酯的含量，每个质量浓度平行测定6次，计算高级脂肪酸乙酯的平均加标回收率和精密度试验相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表2。

表2 3种高级脂肪酸乙酯加标回收率与精密度试验结果Table 2 Results of standard recovery rate and precision tests of 3 kinds of higher fatty acid esters

由表2可知，3种高级脂肪酸乙酯的平均加标回收率为90.10%～116.97%，精密度试验结果的RSD为2.19%～4.65%，表明该方法回收率高，准确度良好，符合白酒中棕榈酸乙酯、油酸乙酯和亚油酸乙酯的分析检测要求。

2.4 白酒样品的高级脂肪酸乙酯检测

2.4.1 不同香型白酒样品的高级脂肪酸乙酯检测

酯类物质是白酒香味的重要组成部分，3种高级脂肪酸乙酯不仅在白酒的呈香过程也起着助香和呈味的作用，在酒体内以不同的强度释放香气，有助于形成白酒的复合香气，形成独特风格的特点，而且是评价白酒质量优劣的最直观的指标之一[22-23]。利用实验所建立的分析方法，对不同香型白酒中高级脂肪酸乙酯含量进行测定，每个样品平行测定3次，计算平均值，检测结果见表3。

表3 不同香型白酒高级脂肪酸乙酯含量测定结果Table 3 Determination results of higher fatty acid ethyl esters contents of different flavor Baijiu mg/mL

由表3可知，11种不同香型白酒样品中，除豉香型白酒未检测出3种高级脂肪酸乙酯外，其余10种香型白酒均检测出3种高级脂肪酸乙酯。其中棕榈酸乙酯含量最高的是酱香型白酒，含量为0.029 2 mg/mL，油酸乙酯含量最高的是老白干香型，含量为0.012 6 mg/mL，亚油酸乙酯含量最高的是酱香型白酒，含量为0.020 5 mg/mL。综合对比3种高级脂肪酸乙酯总量，总含量最高的白酒是酱香型白酒，含量为0.062 2 mg/mL，其次是老白干香型和凤香型白酒，含量分别为0.053 9 mg/mL和0.050 9 mg/mL。高级脂肪酸乙酯属于高沸点物质，酱香型白酒独特的“四高”生产工艺及原料中氮元素含量高可能是其高级脂肪酸乙酯含量较高的原因之一，而豉香型白酒含量较低也可能与其原料中有机氮源和脂肪含量较少有关[10，24-25]。

2.4.2 不同品牌酱香型白酒样品的高级脂肪酸乙酯检测

在研究的基础上，酱香型白酒中3种高级脂肪酸乙酯的含量较高。因此实验选取了市售不同酱香型品牌共计35种酱香型白酒进行3种高级脂肪酸乙酯含量的对比分析，结果见表4。

表4 不同品牌酱香型白酒中高级脂肪酸乙酯含量测定结果Table 4 Determination results of higher fatty acid ethyl esters content in different brands of sauce-flavor Baijiu mg/mL

由表4可知，酱香型白酒的3种高级脂肪酸乙酯的总含量在0.003 5～0.075 8 mg/mL之间。其中MT15-1白酒样品中只检测到了亚油酸乙酯，其余酱香型白酒样品均检测到3种高级脂肪酸乙酯。XT品牌酱香型白酒中所含3种高级脂肪酸乙酯的含量均明显低于其他品牌酱香型白酒，这也可能是XT品牌酱香型白酒口味较寡淡的原因之一。检测结果表明，3种高级脂肪酸乙酯在酱香型白酒中普遍存在，特别是温度降低后会出现絮状浑浊[26-27]，因此，白酒企业还是要不断的提高3种高级脂肪酸乙酯的监测能力，控制其含量，避免出现浑浊，影响白酒的质量。

3 结论

白酒酒尾水油状物的主要成分为高级脂肪酸乙酯，通过其含量的控制也可以实现酒尾的再利用，制成高酸高酯的调味酒，为企业增加效益。因此，对其准确定量显得尤其重要。采用气相色谱（GC）结合内标法，建立了3种高级脂肪酸乙酯的检测方法，并对11种不同香型白酒及不同品牌酱香型白酒中高级脂肪酸乙酯的含量进行了测定。结果表明，该方法能使3种高级脂肪酸乙酯得到很好的分离，3种高级脂肪酸乙酯在各自质量浓度范围内线性关系良好，线性范围为0.003 0～0.400 0 mg/mL，相关系数（R2）均＞0.999，精密度试验结果相对标准偏差均＜5%，平均加标回收率为94.01～116.97%，检出限为0.003 2～0.003 5 mg/mL，定量限为0.010 9～0.011 7 mg/L。对市售11种不同香型白酒中的3种高级脂肪酸乙酯含量进行测定，除豉香型白酒未检测出3种高级脂肪酸乙酯外，其余10种香型白酒均能检出，其中，酱香型白酒含量最高。同时对市售35种不同品牌酱香型白酒中的3种高级脂肪酸乙酯含量进行测定，其总含量在0.003 5～0.075 8 mg/mL之间。该方法准确、灵敏度高，能对白酒中3种高级脂肪酸乙酯进行有效分析，可用于酒类企业日常白酒分析工作，通过控制其含量，避免酒体出现浑浊，影响白酒的质量。