基于LC-MS和GC-MS结合多元统计的白酒酚类成分分析

吴奇霄，余松柏，马 龙，王红梅，黄张君*，王松涛，3，沈才洪，3

（1.泸州品创科技有限公司，四川 泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000；3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000）

白酒是中国的国酒，承载了重要的文化内涵和经济价值[1]。白酒种类繁多，按照酿造工艺和酒体风格的不同被行业内分为了12种香型，浓、清、酱和米香型是白酒的4种基础香型，由这4种香型衍生出了芝麻香、董香、豉香、特香、凤香、兼香、老白干香、馥郁香型白酒[2]。白酒主要成分是乙醇和水，约占总质量的98%，余下2%是各种微量成分，这些微量成分的种类和含量对白酒的品质和风格至关重要。迄今为止，白酒中有2 000余种微量成分被鉴定出，主要有酯类、酸类、醇类、醛类、酮类、酚类、萜烯类、含氮类化合物等[3-4]。其中，酚类化合物在白酒中的含量尽管较低，但其是白酒重要的风味组成成分，对白酒的品质有着一定的影响。白酒中不挥发性酚类化合物主要是一些游离态酚酸类化合物，有香豆酸、阿魏酸、香草酸等[5]，为白酒贡献酸、苦、涩的复合口感，有助于提升白酒味道的层次感[6]。白酒中挥发性酚类化合物主要有苯酚、4-甲基苯酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、香兰素等[7-8]，这些成分赋予了白酒烟熏香、窖陈香、粮香等香气特征[9-10]。此外，酚类化合物也是白酒中重要的健康因子，具有抗氧化、抗肿瘤、提升机体免疫力等功效[11-12]。

白酒中的挥发性酚类化合物主要使用气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）进行测定。ZHAO D R等[13]使用液液萃取法结合GC-MS从古井贡酒中检测到了香兰素、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚等7种酚类化合物；史冬梅等[7]使用直接进样法结合GC-MS检测了103种酒样中的6种挥发性酚类化合物。此外，可以使用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定白酒中挥发性酚类化合物，但需要有复杂的前处理过程，寻思颖等[14-15]利用酚类化合物的荧光特性，以β-环糊精作为手性拆分剂，用搭配荧光检测器（fluorescence detector，FLD）的高效液相色谱（HPLC-FLD）建立了白酒中苯酚、愈创木酚、4-甲基愈创木酚等10种挥发性酚类化合物的测定方法。白酒中不挥发性酚类化合物的检测方法主要有HPLC法和液相色谱-质谱联用法（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）。吴子阳等[5]采用固相萃取结合HPLC测定了白酒中没食子酸、香豆酸、丁香酸、原儿茶酸水合物和阿魏酸的含量，其前处理方法较为复杂；王银辉等[16]将白酒样品氮吹处理后，使用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析了酒样中没食子酸、阿魏酸、咖啡酸等7种化合物的含量。为更好地分析多个样品间的差异，近年来，主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚类分析（cluster analysis，CA）、判别分析（discriminate analysis，DA）等多元统计方法已用来对白酒香型[17]、产地[18]和基酒年份[19]等信息进行分类和判别，成为解析白酒特征重要的分析方法。

本研究建立了利用LC-MS和GC-MS分析白酒中7种不挥发性和7种挥发性酚类化合物的测定方法，分析了12种香型38个白酒样中酚类化合物的含量，运用聚类分析和主成分分析对不同香型白酒中酚类化合物种类及含量的差异进行分析，为白酒风味解析与品质研究提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

38个白酒样品（浓香型6个、清香型4个、酱香型5个、米香型3个、老白干香型2个、兼香型3个、凤香型2个、特香型4个、馥郁香型2个、豉香型3个、芝麻香型2个、董香型2个，分别对各酒样进行了编号）：市售。

p-羟基苯甲酸、香豆酸、没食子酸、阿魏酸、4-甲基愈创木酚和4-甲基苯酚（纯度均＞99%）：上海阿拉丁试剂公司；香草酸、丁香酸和儿茶酚（纯度均＞98%）：上海麦克林生化科技有限公司公司；香兰素、4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚（纯度均＞99%）：上海源叶生物科技有限公司；苯酚和愈创木酚（纯度均＞99%）：上海安谱实验科技股份有限公司；无水乙醇、冰乙酸、甲醇和乙腈（均为色谱纯）：成都诺尔施科技有限责任公司。

1.2 仪器与设备

LC-MS 2020液相色谱质谱联用仪、GC-MS 2030气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；DB-WAX气相色谱柱（60 m×250 μm×0.25 μm）、Polaris C18-A液相色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）：美国安捷伦科技有限公司；PAL RTC多功能自动进样器：广州智达实验室科技有限公司；N-1300D-W旋转蒸发仪：日本东京理化器械株式会社；ML304T分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q Synergy超纯水系统：德国默克公司。

1.3 方法

1.3.1 白酒中不挥发性酚类化合物的测定

样品前处理：精确量取10 mL酒样，用旋转蒸发仪（水浴温度55 ℃、真空压力20 kPa）将酒样蒸干，加入1 mL甲醇复溶，过0.22 μm有机滤膜，得到样品溶液，待LC-MS进样分析。

LC-MS分析液相色谱条件：安捷伦Polaris C18-A液相色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.01%乙酸水溶液；梯度洗脱条件：0～17 min（84%A），17～30 min（84%→70% A），30～32 min（70%→84% A），30～34 min（84%A）；流速0.6 mL/min；进样量10 μL；柱温为25 ℃。质谱条件：电喷雾离子（electron spray ionization，ESI）源，负离子模式扫描；脱溶剂管（desolvation line，DL）温度为250 ℃；加热模块温度为200 ℃；氮气雾化气流速为1.5 L/min。定性采用全扫描模式（Full Scan），质量扫描范围100～300 m/z，根据Scan模式筛选的定量离子，使用选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）扫描模式对不挥发酚类化合物进行定量分析。

1.3.2 白酒中挥发性酚类化合物的测定

样品前处理：将1.5 mL酒样过0.22 μm有机滤膜后置于棕色进样瓶中，待GC-MS进样分析。

气相色谱条件：DB-WAX色谱柱（60m×250μm×0.25μm）；进样口温度250 ℃，不分流进样；载气为氦气（He）（纯度99.999%）；流速1.00 mL/min；升温程序为50 ℃保持2 min，以6 ℃/min升温至230 ℃，保持15 min。质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度为230 ℃，接口温度为250 ℃；溶剂延迟10 min。定性采用全扫描模式，质量扫描范围65～300m/z，扫描时间为0.2s。定量采用选择离子监测（SIM）扫描模式。

1.3.3 数据处理

样品平行测3次，取平均值。使用SPSS 26.0软件对数据进行主成分分析，使用Origin 2021软件绘制热图、聚类分析树状图和主成分分析载荷与得分双重图。

2 结果与分析

2.1 酚类化合物定性与定量方法的确定

采用LC-MS和GC-MS的Scan模式对白酒中14种典型酚类化合物进行定性分析，每种化合物筛选出3个定性离子，其中响应值最高的离子作为定量离子，结果见表1。

表1 14种酚类化合物的定性及定量离子Table 1 Qualitative and quantitative ions of 14 phenols

由表1可知，不挥发性酚类化合物没食子酸、p-羟基苯甲酸、原儿茶酸、丁香酸、香草酸、香豆酸和阿魏酸的定量离子分别是169、153、289、197、167、163和193；挥发性酚类化合物愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚和香兰素的定量离子分别是109、138、94、137、107、107和151，其中4-甲基苯酚定性离子为107、108、77，4-乙基苯酚定性离子为107、122、77。将使用SIM对14种酚类化合物进行定量分析。

采用外标法对酚类化合物进行定量分析，结果见表2。由表2可知，14种酚类化合物线性相关系数（R2）均≥0.997，线性关系良好，检出限为0.62～6.42 μg/L，定量限为1.44～12.25 μg/L，日内精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均≤4.11%，日间精密度试验结果相对标准偏差均≤8.98%，加标回收率为86.50%～104.35%，说明该方法的精密度和准确度较高，能够满足白酒中酚类化合物分析的要求。

表2 14种酚类化合物的标准曲线回归方程、线性范围、检出限、定量限、精密度及加标回收率Table 2 Standard curve regression equation,linear range,limits of detection,limits of quantification,precision and recoveries of 14 phenols

2.2 酒样中酚类化合物含量的测定结果

38个白酒样品中酚类化合物含量的测定结果见表3。

由表3可知，这些酒样中酚类化合物的总含量为131.75～1 856.83 μg/L，总含量最高和最低的酒样分别是馥郁香型白酒Fuyu-2和豉香型白酒Chi-2。总体而言，白酒中挥发性酚类化合物含量和种类显著多于不挥发性酚类化合物。4种基础香型白酒中，浓香型白酒的这14种酚类化合物的总含量相对较高，然后依次是酱、米和清香型白酒。衍生香型白酒中，特、凤、馥郁和芝麻香型白酒中总酚含量较高。不同香型白酒中酚类化合物差异主要是由于白酒生产酿酒原料和酿造工艺不同[6]。

不挥发性酚类化合物是白酒中的滋味物质和健康成分，在不同香型白酒中均有检出。香草酸在所有酒样中均有检出，含量范围为0.64～18.42 μg/L；有29个酒样含阿魏酸，含量范围为1.59～186.56 μg/L；在13个酒样中检测到了香豆酸，含量范围为0.59～9.61 μg/L；没食子酸和丁香酸分别只在5个酒样中检出，含量范围分别为0.21～1.13 μg/L和0.70～2.95 μg/L；p-羟基苯甲酸和原儿茶酸分别在4个酒样中检出，含量分别为0.30～0.86 μg/L和0.34～1.35 μg/L，首次在酱、兼、凤香型成品白酒中检出了p-羟基苯甲酸，此前的研究仅从芝麻和老白干香型的原酒中检测出了p-羟基苯甲酸[20]。酱香型白酒的香豆酸、香草酸和阿魏酸的含量高于其他香型白酒，这结果与吴子阳等[5]的研究结果一致。白酒的不挥发性酚类化合物是酿酒原粮中的酚类物质经微生物转化或酶解结合态酚类的酯键而形成的，其在提升白酒风味层次感的同时还具有抗氧化的作用[21-22]。

挥发性酚类化合物是白酒风味成分的重要组成部分，会影响白酒的品质[23]。4种基础香型白酒中，愈创木酚和4-甲基愈创木酚在酱、清、米香型白酒中均检测到，浓香型白酒仅在Strong-3中检测到少量的愈创木酚。愈创木酚具有水果香、花香等气味特征，其含量范围为17.04～98.94 μg/L，含量最高的酒样是酱香型白酒Soysauce-2。4-甲基愈创木酚呈现烟熏风味，其含量范围为19.96～258.13 μg/L，清香型白酒Light-3的含量最高。38个酒样均含有苯酚，含量为11.80～397.94 μg/L，其中浓香型白酒Strong-6的含量最高，老白干香型白酒Laobaigan-2的含量最低，苯酚可为白酒贡献酚味[24]。4-乙基愈创木酚主要在酱、清、米、老白干、兼和凤香型白酒中检出，其中老白干香型白酒Laobaigan-2含量最高为191.76 μg/L。浓、酱、兼、凤、特、馥郁、董香型等25个酒样中检测到了4-甲基苯酚，是白酒中含量相对较高的酚类成分，其中馥郁香型白酒Fuyu-2中4-甲基苯酚含量最高为1 371.46 μg/L。4-甲基苯酚是白酒中窖泥味的主要来源，在低浓度有助于呈现窖香，但在浓度较高时具有泥臭味[25]。有32个酒样中都含有4-乙基苯酚，其含量范围为1.97～220.16 μg/L，含量最高的酒样是浓香型白酒Strong-1，而在浓香型白酒Strong-4和Strong-5中未检出。4-乙基苯酚的阈值为618 μg/L[24]，当4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚的总含量低于400 μg/L时可为白酒贡献革香与烟熏香[12]。与其他6种挥发性酚类化合物相比较，香兰素的含量较低，其含量最高的酒样是米香型白酒Rice-2为62.86 μg/L。香兰素会为白酒贡献奶油香、花香、蜜香风味[7]。白酒中的挥发性酚类化合物具有抗氧化和清除自由基等作用[11-12]，这些挥发性成分主要在发酵中后期生成，其中梭状芽孢杆菌、甲烷杆菌是产生苯酚、4-甲基苯酚和4-乙基苯酚的主要菌种[10]。

2.3 不同香型白酒酚类化合物差异性分析

2.3.1 聚类分析

为了更好地分析不同香型白酒酚类化合物的差异，选择了在各样品中检出频率和含量相对较高的3种不挥发性酚类和7种挥发性酚类化合物进行分析。对这些酚类化合物的质量浓度取对数后，绘制热图并进行聚类分析，结果见图1。热图色块的颜色从蓝到红表示酒样中酚类化合物的含量由低到高，且颜色越蓝表示含量越少，颜色越红表示含量越多。由图1可知，38个白酒样品中酚类化合物的含量有差异，酒样中苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚的含量相对较高，香草酸和香豆酸的含量较少。根据酚类化合物在不同酒样中含量的差异，可以通过聚类分析对酒样进行归类。由图1可知，4种基础香型白酒中，由于清香型和米香型白酒酚类化合物含量比较接近，被进一步归为了一类，可与浓香型和酱香型白酒较好区分。凤香型和老白干香型白酒被归为一类的原因是这两种香型白酒中苯酚、4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚含量分布相近。兼香型和酱香型白酒被可被归为一类，可能是由于它们的酿造过程中都使用了高温大曲和堆积发酵工艺[17]，导致其酚类化合物的含量分布较为相同。豉、馥郁、特、浓、董和芝麻香型被归为一类，这些香型白酒中的4-甲基苯酚含量较高，而其余酚类化合物种类和含量差异较小。同时，有例外的情况是米香型白酒Rice-3、酱香型白酒Soysauce-4和浓香型白酒Strong-2，在与其对应香型的聚类分析中呈现离散现象，说明厂家、生产环境、工艺特征的不同会导致同一香型白酒间存在一定的差异。

图1 不同香型白酒酚类化合物的聚类分析热图Fig.1 Heat map of cluster analysis of phenols in different flavor types of Baijiu

2.3.2 主成分分析

主成分分析是能够将多个数据信息浓缩，并保留数据大量信息的分析方法[26]，38个酒样中酚类化合物含量主成分载荷矩阵结果见表4。

表4 不同香型白酒中酚类化合物主成分载荷矩阵Table 4 Principal component loading matrix of phenols in different flavor types of Baijiu

由表4可知，3个主成分的累计方差贡献率为72.33%，说明前3个主成分基本包含了白酒种酚类化合物组成的大部分信息，可用于分类与综合贡献评价。在前3个主成分中，PC1的贡献率为35.88%，主要综合了4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚的信息；PC2的贡献率为22.48%，其中贡献最大的是香豆酸，对应的特征值为0.52；PC3的贡献率为13.97%，其中贡献最大的4-乙基苯酚，对应的特征值为0.64。

以3个主成分PC1、PC2和PC3及其方差贡献率建立综合得分模型PC综合，其中PC综合是因变量，PC1、PC2和PC3是自变量，它们的线性组合方程是：PC综合=35.88% PC1+22.48%PC2+13.97%PC3。12种香型白酒的各主成分得分值和综合得分值见表5。

表5 12种香型白酒主成分得分值和综合得分值Table 5 Principal component scores and comprehensive scores of 12 flavor types of Baijiu

由表5可知，在PC1中得分绝对值最高的是老白干型白酒Laobaigan-2，为3.93；PC2中酱香型白酒Soysauce-5的得分绝对值最高，为3.58；PC3中得分绝对值最高的是浓香型白酒Strong-1，为2.29。综合得分绝对值越高代表酚类化合物对该酒样分类的综合贡献越大，清、米、老白干、特、馥郁和董香型白酒以及酱香型、浓香型中部分酒样的综合得分绝对值相对较高，说明这些香型白酒通过酚类化合物含量的差异能实现很好的分类，而兼、凤、豉和芝麻香型白酒的综合得分绝对值相对较低，分类效果相对较差。

以PC1的载荷值为x轴，PC2为y轴作图得到主成分载荷和得分双重图，见图2。

图2 12种香型白酒酚类化合物的主成分载荷和得分双重图Fig.2 Principal component loading and score dual plots of phenols in 12 flavor types of Baijiu

由图2可知，PC1中4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、苯酚和4-甲基苯酚的载荷系数绝对值较高，PC2中香草酸、香豆酸、香兰素和愈创木酚的载荷系数绝对值较高。同一香型白酒的不同酒样分布相对集中，4种基础香型白酒可实现初步归类，与聚类分析结果是一致的。米香型白酒有2个酒样在第1象限，还有1个米香型酒样分布在第4象限，离清香型白酒分布较近，影响其分布的主要成分是4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚。酱香型白酒分布在第1和第2象限，与其他香型白酒的距离较远，影响其分布的特征酚类化合物是香草酸、香豆酸、香兰素和愈创木酚。特香型和兼香型白酒主要分布在第2象限，其中兼香型在y轴方向处于酱香型和浓香型白酒中间，影响这2种香型白酒分布的特征酚类化合物是苯酚。浓、董、芝麻、馥郁和豉香型白酒主要分布在第3象限，4-甲基苯酚是影响它们分布的特征酚类化合物。凤香型和老白干香型白酒分布在第4象限，距离清香型白酒的分布相对较近，4-乙基苯酚是影响其分布的特征酚类化合物。通过主成分分析可以找到影响不同香型白酒分布的特征酚类化合物，进而解析不同香型白酒间的相似性和差异性。

3 结论

运用LC-MS和GC-MS建立7种不挥发性和7种挥发性酚类化合物的检测方法，在检测范围内各酚类化合物的线性相关系数（R2）≥0.997，检出限为0.62～6.42 μg/L，定量限为1.44～12.25 μg/L，日内精密度试验结果RSD≤4.11%，日间精密度试验结果RSD≤8.98%，加标回收率范围为86.50%～104.35%，可用于白酒中酚类化合物的分析。对12种香型38个白酒样品的分析结果表明，白酒中挥发性酚类化合物的种类和含量较不挥发性酚类化合物多，不同香型白酒的酚类化合物组成和含量有较为明显的差异，浓香型及其相关衍生香型白酒的总酚含量相对较高，其中馥郁香型白酒Fuyu-2的总酚含量最高为1 856.83 μg/L。阿魏酸较其他不挥发性酚类化合物在白酒中的含量更高，范围为1.59～186.56 μg/L，且首次在酱、兼、凤香型成品白酒中检测到p-羟基苯甲酸。4-甲基苯酚是白酒中含量相对较高的挥发性酚类化合物，香兰素的含量相对较低。多元统计分析的结果表明，根据酚类化合物在不同酒样中含量的差异，可以实现不同香型白酒的初步归类，由于清香型和米香型白酒酚类化合物的含量比较接近，影响它们分布的特征酚类化合物是4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚，在进一步分类中被归为一类。浓香型和酱香型白酒的区分度较好，影响酱香型分布的特征酚类化合物是香草酸、香豆酸、香兰素和愈创木酚。浓、董、特、芝麻、馥郁和豉香型在进一步分类时被归为一类，影响它们分布的特征酚类化合物是4-甲基苯酚。白酒中酚类化合物准确的定量分析可为白酒风味和健康的研究提供数据支持，再进一步结合多元统计分析可以找到区分不同香型白酒特征酚类化合物，为白酒品质研究提供理论依据。