腐乳源乳酸乳球菌17M1高密度培养条件研究

南树港，李 理

（华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州 510641）

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）属兼性厌氧的革兰氏阳性细菌，是乳酸菌中一种重要的模式菌，具有潜在的应用价值[1]。乳酸乳球菌凭借其快速酸化、水解蛋白以及产生挥发性风味物质的能力广泛应用于食品发酵领域，其中最具代表性的菌种为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis）和乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactissubsp.cremoris）[2]。LANGA S等[3]研究发现，乳酸乳球菌的添加对奶酪的物理化学性质和感官特性产生了积极的影响，并从中分离出乳酸链球菌肽（nisin）等抑菌物质。除此之外，由于其易于生长、载体系统可用且发展良好等优点，探究乳酸乳球菌作为细胞工厂表达活性物质的潜力也是目前的一大热点[4-5]。乳酸乳球菌具有广泛的自然栖息环境，从天然植物、发酵食品以及人体生殖器官中均发现了该菌种的存在[6-8]。腐乳作为中国传统发酵食品，其加工不经过灭菌步骤，环境中的微生物对腐乳的风味及品质产生了重要影响[9-10]。乳酸乳球菌作为腐乳发酵过程中的优势菌群，在产品风味的改善、致病菌抑制等方面均可能产生重要影响[11-12]。

为满足工业生产的需求，必须保证发酵菌株的活菌数和发酵活力，其中，营养成分以及培养条件对微生物的生长繁殖有至关重要的作用。董安利[13]研究发现，乳酸乳球菌乳酸亚种BL19的最优培养基组成为海藻糖5.10 g/L、蔗糖15.31 g/L、酵母蛋白胨14.79 g/L、酵母浸粉44.38 g/L、磷酸二氢钾19.63 g/L、氢氧化钠4.04 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、维生素B2（vitamin B2，VB2）0.50 g/L，调整pH为7.7，采用该培养基于30 ℃条件下培养5～6 h，活菌数可达（8.03±0.59）×109CFU/mL。除此之外，培养基的优化不仅要保证获得大量的菌体，同时还要考虑其成本问题[14]。陈雪[15]以营养丰富且价格低廉的乳清粉作为基础培养基，通过添加酵母粉、酶水解酪蛋白胨以及多种促生长因子等显著提高了乳酸乳球菌KLDS4.0326和KLDS4.0424的活菌数；周剑忠[16]同样以乳清粉为基础培养基对微囊化的乳酸乳球菌进行高密度培养，通过添加浓缩乳清蛋白20.00 g/L，酵母提取物7.63 g/L，碳酸钙6.20 g/L，硫酸镁0.20 g/L和硫酸锰0.03 g/L，并调整初始pH值为6.50，30.4 ℃培养22 h，其活菌数对数值高达11.15。

乳酸乳球菌17M1是课题组前期从腐乳毛坯中分离鉴定的菌株，具有安全、耐盐以及发酵豆基食品的能力，应用前景广阔。豆腐乳清是豆腐制备过程中产生的黄色沥水，富含大豆低聚糖、蛋白质、异黄酮等营养物质[17-18]，是微生物的良好培养基。因此，本研究以豆腐乳清作为基础培养基，以菌体密度和活菌数为评价指标，通过响应面法（response surface methodology，RSM）优化乳酸乳球菌17M1的培养基配方，并研究其培养条件，以期为乳酸乳球菌17M1直投式发酵剂的制备提供依据，为其工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸乳球菌17M1：分离纯化自广东某腐乳厂的腐乳毛坯，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.61396。

豆腐乳清（pH值为5.45，酸度值为18.43°T，可溶性固形物含量为4.73%，总氮含量为0.468 g/L，总蛋白含量为2.925 g/L）：取自广东某腐乳厂，经离心（8 000×g，10 min）去除杂质后作为基础培养基。

生长因子的制备[19]：将100 g新鲜黄瓜、番茄洗净、切碎，加入100 mL蒸馏水煮沸5 min，榨汁、过滤并定容至200 mL。

M17肉汤培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂、大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨（均为生化试剂）：广东环凯微生物科技有限公司；柠檬酸铵（分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司；抗坏血酸钠（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；D-海藻糖：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ME 204/02型电子天平：梅特勒托利多仪器有限公司；LS-28HD型立式压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；SE-CJ-1FD型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；DHP-9052型电热恒温培养箱：上海申贤恒温设备厂；JW-3021HR型高速冷冻离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；Marker SynergyH1型多功能酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；2WAJ型阿贝折光仪：上海天美科学仪器有限公司；KDN-102C型凯式定氮仪：上海纤检仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸乳球菌17M1的活化与培养

吸取适量-80 ℃冰箱中保藏的乳酸乳球菌17M1菌液至M17肉汤培养基中，30 ℃条件下恒温静置培养24～48 h，使菌株复壮。以3%（V/V）的接种量接入5 mL M17肉汤培养基中，在30 ℃条件下恒温静置培养24 h。

1.3.2 乳酸乳球菌17M1增殖培养基配方优化响应面试验

（1）部分因子试验设计及关键因子的筛选

为满足乳酸乳球菌17M1的增殖需求，筛选出适合菌株生长的因子，以菌体密度（OD600nm值）作为响应值，选用D-海藻糖（A）、大豆蛋白胨（B）、胰酪蛋白胨（C）、柠檬酸铵（D）、抗坏血酸钠（E）、番茄汁（F）和黄瓜汁（G）添加量7个因素进行7因素2水平1/4部分因子试验[20]，共进行64次试验（重复2次）和3次中心点试验，快速获得一阶拟合方程，获得显著影响因子。

（2）最陡爬坡试验设计

根据部分因子试验结果按照显著影响因素影响效应的大小及其与响应值之间的相关系数设计显著因子的最陡上升路径，从而快速逼近最优响应区域。以OD600nm值作为响应值，得到最大响应值所对应的显著因子成分比例。

（3）中心组合旋转设计试验

在得到最大响应值对应的最优区域后，进行中心组合旋转设计试验，以活菌数作为响应值，得到响应值和各因子变量关系的二阶拟合方程，从而获得最佳组合设计。

（4）验证试验

为验证模型的有效性及重现性，选用中心组合旋转设计试验中分析得到的最优点、最高点、最低点、中心点以及M17肉汤培养基和基础培养基对乳酸乳球菌17M1进行培养，对菌株的生长情况进行对比。

1.3.3 乳酸乳球菌17M1增殖培养条件研究

以最优增殖培养基为基础，考察培养温度（25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃）、初始pH值（5.15、5.65、6.15、6.65）及培养时间（0～30 h）对乳酸乳球菌17M1增殖的影响。

1.3.4 数据处理

采用Design Expert 8.0.6设计部分因子试验以及旋转中心组合试验，试验数据采用SPSS 19.0进行显著性分析（P＜0.01）。所有试验进行两次重复。

2 结果与分析

2.1 乳酸乳球菌17M1增殖培养基配方优化响应面试验结果

2.1.1 部分因子试验设计及关键因子的筛选

七因素两水平全因子设计需要进行128次试验，包含单因子、双因子以及多因子之间的相互影响[21-22]。假定忽略某些高阶因子的相互作用，部分因子试验可以减少试验运行次数，从而快速筛选出关键因子[20]。本试验采用七因素两水平1/4部分因子试验，包括32个试验点和3个中心点，在试验设定的条件下测定菌株的菌体密度。

豆腐乳清中氮源（0.468 g/L）含量比商业M17肉汤培养基（10.000 g/L）中的低，另外，在前期的试验结果发现，乳酸乳球菌17M1对豆腐乳清中棉子糖和水苏糖的利用率比较弱，对D-海藻糖的利用率最高。番茄汁和黄瓜汁富含多种维生素、微量元素等生长因子，为菌株的生长提供矿物质、B族维生素等多种营养成分[23-24]。考虑菌株增殖所需要的碳源、氮源、缓冲盐、生长因子等，对D-海藻糖（A）、大豆蛋白胨（B）、胰酪蛋白胨（C）、柠檬酸铵（D）、抗坏血酸钠（E）、番茄汁（F）和黄瓜汁（G）添加量7个因子进行了考察。部分因子试验设计及结果见表1，回归分析见表2。

由表1可知，不同因素水平乳酸乳球菌17M1的菌体密度为0.59～0.98。由表2可知，模型显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），决定系数R2=0.892 2，调整决定系数R2Adj=0.863 2，表明模型与实际情况拟合良好。该模型回归系数显著性检验表明，七个因子中，大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨以及柠檬酸铵显著影响乳酸乳球菌17M1在基础培养基（豆腐乳清）中的增殖（P＜0.01）。

表2 部分因子PB设计试验结果方差分析Table 2 Variance analysis of PB experimental results of partial factor design

蛋白胨富含自由氨基酸、多肽、蛋白质以及糖类、维生素等，能更好的促进乳酸乳球菌的生长[25-26]。另外，研究发现复合氮源比单一氮源能更加有效地促进菌株生长[27]。培养基中添加合适的缓冲盐可以中和培养液中的酸性物质，减缓菌液pH的下降速率，并且可以调节细胞渗透压，保护细胞[28]。吴军林等[29]研究发现，柠檬酸盐的添加可以提高乳酸菌的菌体密度。

鉴于D-海藻糖、抗坏血酸钠、番茄汁和黄瓜汁的偏差平方和较小，故忽略不计。得到回归方程：Y=0.76+0.050B+0.046C+0.085D。从回归方程可以看出，大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨和柠檬酸铵的回归系数均为正数，说明这3个因素对菌体密度存在正向的影响，且影响程度顺序为：柠檬酸铵＞大豆蛋白胨＞胰酪蛋白胨。因此，确定大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨和柠檬酸铵为影响乳酸乳球菌17M1生长的关键因子。

2.1.2 最陡爬坡试验设计

根据表2分析得到的显著影响因素，进一步利用最陡爬坡试验使显著影响因素逼近最佳响应区域。因此，将柠檬酸铵作为最陡爬坡试验的基准步调（具有最大回归系数），以0.5%的增长作为爬坡试验的步长，大豆蛋白胨和胰酪蛋白胨分别以0.6（0.050/0.085≈0.6）和0.5（0.046/0.085≈0.5）的增长作为试验的步长，最陡爬坡试验设计及结果见表3。由表3可知，不同比例的大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨以及柠檬酸铵的添加对乳酸乳球菌17M1的菌体密度影响不同。当大豆蛋白胨为1.75%、胰酪蛋白胨为1.50%和柠檬酸铵为2.75%时，菌体密度最大，OD600nm值达到1.04±0.01，故将该条件作为旋转中心组合试验设计的中心点。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Design and results of steepest climbing tests

2.1.3 中心组合旋转设计试验及响应面分析

以大豆蛋白胨1.75%、胰酪蛋白胨1.50%以及柠檬酸铵2.75%作为中心组合旋转设计试验的中心点，取α=±1.682进行中心组合旋转设计，试验因素与水平见表4，试验设计及结果见表5，方差分析见表6。

表4 中心组合旋转设计试验因素与水平Table 4 Factors and levels of center combination rotation design tests

表5 中心组合旋转设计试验设计及结果Table 5 Design and results of center combination rotation design tests

表6 中心组合旋转设计试验结果的方差分析Table 6 Variance analysis of center combination rotation design tests results

采用Design Expert 8.0.6对表6数据结果进行多元二次回归拟合，得到多元二次回归方程为：Y=213.63+6.15B+10.91C-29.15D+2.75BC-6.00BD-3.2CD-19.73B2-17.97C2-24.15D2。由表6可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），决定系数R2=0.930 1，调整决定系数R2Adj=0.971 3，表明模型与实际情况拟合良好。一次项C和D及二次项B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项B及交互项BD对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。

根据模型分析结果，得到乳酸乳球菌17M1生长的最佳培养基配方为大豆蛋白胨2.01%、胰酪蛋白胨1.69%、柠檬酸铵2.30%。为便于实际操作，将最优培养基配方修正为大豆蛋白胨2.00%、胰酪蛋白胨1.70%、柠檬酸铵2.30%。此优化培养基条件下菌落数预测值可达2.26×109CFU/mL。响应面图反映了各因素及其之间的相互作用，等高线的形状可以表示交互作用的强弱，各因素间交互作用对乳酸乳球菌17M1活菌数影响的响应面及等高线见图1。由图1可知，响应曲面呈凸形，存在最高点，且大豆蛋白胨与柠檬酸铵间交互作用对乳酸乳球菌17M1活菌数影响的等高线呈椭圆形，交互作用显著，与方差分析结果一致。

图1 大豆蛋白胨、胰酪蛋白胨和柠檬酸铵添加量间交互作用对乳酸乳球菌17M1活菌数影响的响应面及等高线Fig.1 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between soybean peptone,casein tryptone and ammonium citrate addition on the viable count of Lactococcus lactis 17M1

2.1.4 验证试验

为验证响应面试验设计的可靠性及结果的重现性，以M17肉汤培养基为对照，在30 ℃条件下培养24 h，测定乳酸乳球菌17M1的活菌数，结果见表7。由表7可知，乳酸乳球菌17M1在最优培养基上的生长情况最好，活菌数实际值为2.46×109CFU/mL，与M17肉汤培养基相比提高了1.37倍。因此，采用RSM法优化增殖培养基各参数准确可靠，且增殖培养基在降低成本的情况下有效提高了乳酸乳球菌17M1的菌体生长量。

表7 验证试验结果Table 7 Results of validation tests

2.2 乳酸乳球菌17M1增殖培养条件研究

2.2.1 培养温度和初始pH值对乳酸乳球菌17M1生长的影响

在最优增殖培养基下，培养温度及初始pH值对乳酸乳球菌17M1生长的影响见表8。由表8可知，不同的培养条件对乳酸乳球菌17M1的OD600nm值有显著影响（P＜0.01）。随着初始pH值及培养温度的升高，OD600nm值均呈先升高后下降的趋势，当初始pH值和培养温度分别为6.15和37 ℃时，OD600nm值均最高，分别为1.94±0.008、2.00±0.011。综上，乳酸乳球菌17M1的最佳培养条件为初始pH6.15，培养温度37℃。

表8 初始pH值及培养温度对乳酸乳球菌17M1菌体密度的影响Table 8 Effect of initial pH and culture temperature on the cell density of Lactococcus lactis 17M1

2.2.2 培养时间对乳酸乳球菌17M1生长的影响

在最优培养基以及最适培养条件下测定乳酸乳球菌17M1的生长曲线，结果见图2。

图2 培养时间对乳酸乳球菌17M1活菌数的影响Fig.2 Effect of culture time on the viable count of Lactococcus lactis 17M1

由图2可知，随着培养时间的延长，菌株17M1的菌落数呈先升高后下降的趋势，当培养15 h时，活菌数达到最大值，为1.17×1010CFU/mL，因此，选择15 h作为乳酸乳球菌17M1菌体增殖培养基的最适培养时间。

3 结论

本研究以豆腐乳清为基础培养基，通过响应面试验得到乳酸乳球菌17M1高密度培养的最佳发酵培养基配方为：大豆蛋白胨2.00%，胰酪蛋白胨1.70%，柠檬酸铵2.30%。采用该培养基，在初始pH值6.15，37 ℃培养15 h后，菌株17M1的活菌数达到最大，为1.17×1010CFU/mL，高于M17肉汤培养基活菌数（1.04×109CFU/mL）。