大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统

郎 松，张艳微，郑汉青，徐林钰，汪路涵，巩 岩

（1. 中国科学技术大学 生物医学工程学院(苏州) 生命科学与医学部, 江苏 苏州 215163；2. 中国科学院 苏州生物医学工程技术研究所, 江苏 苏州 215163）

1 引 言

现代生物学和生物医学领域迫切需要大视场、高分辨率的显微成像技术和仪器对生物样品进行兼顾“全局形态”和“细节特征”的跨尺度观测，以满足重大科学问题的研究需求。在脑科学研究领域，需要在全脑范围内获取介观尺度的单神经元结构和功能信息，揭示脑连接及脑活动的运行机制[1-2]；在发育生物学和胚胎学研究领域，需要对发育早期的胚胎进行快速三维成像，同时以亚细胞尺度的分辨率对器官或组织进行更加精细的追踪分析[3-4]；在肿瘤学研究领域，需要对活体肿瘤组织进行大视野、亚细胞分辨率成像，进而对肿瘤发生和发展的机理、肿瘤分子诊断及边界识别等开展研究[5-6]。

然而，通过传统的显微镜捕捉到的图像，样品的成像范围和图像的细节水平间存在矛盾，即成像视场（Field of View, FOV）和分辨率相互制约，这主要受限于系统的空间带宽积（Space Bandwidth Product, SBP）。空间带宽积指显微系统的成像视场中可解析像素的数量，用于表征系统所传递的信息量。显微系统的空间带宽积由显微物镜的空间带宽积和探测器的空间带宽积共同决定。一般而言，探测器的空间带宽积（指探测器的像素数）需与显微物镜的空间带宽积相匹配。显微物镜的空间带宽积与成像视场成正比，与分辨率的平方成反比，即SBP=FOV/(0.5ε)2，其中，系数0.5来源于奈奎斯特采样定律，ε为显微物镜的横向分辨率，其由显微物镜的工作波长和数值孔径（Numerical Aperture，NA）决定。现有商业显微镜的空间带宽积通常在几兆至几十兆范围内。一方面，受设计、加工和装调工艺的限制，显微物镜的空间带宽积难以提升，此外，商业显微镜的物镜需满足互换性要求，通常按照一定行业标准或企业标准设计，这也限制了显微物镜的设计空间；另一方面，商业图像传感器的像素数量有限，无法满足高空间带宽积成像需求。

为了突破成像系统空间带宽积的限制，研究者们采取了以下两种方法：(1)扫描拼接成像[7-10]；(2)傅立叶切片成像[11-12]。然而，这两类方法的缺点是全视场成像速度慢，在成像过程中样本需要保持静态，这在生物动力学的研究中很难实现[13]。在半导体器件制造领域，为了提高成像系统的空间带宽积，研究者们开发了大视场浸水光刻物镜及成像系统，但这些系统仅适用于单色光（例如波长为193 nm的单色光）和固定物距的工作场景，难以应用于生物医学成像领域[14]。在生物医学成像领域，英国科学家McConnell 等人研发了大视场高分辨率显微物镜 Mesolens[14-16]。该显微物镜成像视场为 Φ6 mm，数值孔径为0.47，基于Mesolens设计的共聚焦显微镜横向分辨率和轴向分辨率分别为 0.7 μm 和 7 μm，可以对直径达Φ6 mm、厚达3 mm的生物样本进行三维成像，由于采用点扫描共聚焦成像的策略，该显微镜需要大约 200 s才能获得全视场的图像，这极大地限制了其在高动态样品上的应用[14-16]。美国科学家Spencer LaVere Smith团队开发了大视场、双路径扫描的双光子显微镜系统Diesel2p，该系统在全视场成像模式下，成像视场略小于5 mm×5 mm，横向分辨率约为1 μm，轴向分辨率约为8 μm，成像深度可达500 μm；在多区域成像模式下，两束独立的激光同时在两个不同的区域采集图像，成像视场均为1.5 mm × 5 mm，分辨率为1.5 μm×1.2 μm，成 像速率为3.84 frame/s[17]。采用双光子成像技术的Diesel2p较好地抑制了离焦信号的干扰且具有较深的成像穿透深度，但是其成像速度和成像分辨率仍有较大的提升空间。国内方面，戴琼海院士团队研发了超宽视场高分辨率实时显微成像仪器（RUSH），采用特制高空间带宽积显微物镜（成像视场为10 mm×12 mm，数值孔径为0.35）和35个像素为2 560 × 2 160的相机阵列，构建了多尺度曲面中继协同的显微成像系统，实现了兼具1 cm×1.2 cm超宽视场、1.2 μm高分辨率、30 frame/s高帧率、5.1 GPixel/s高数据通量的生物动态成像[13]。然而，RUSH系统的轴向分辨率偏低，仅有15.52 μm±1.80 μm，而且视场拼接的成像方式会不可避免地降低全视场图像中重叠区域的分辨率和强度。此外，上述高空间带宽积显微成像系统共同的特征是体积庞大、实施成本高昂、难以推广应用。

为了获取大体积生物组织的三维精细结构，显微成像系统需具备光切片成像能力。通常采用两种策略实现光切片成像[18]：一种是通过控制照明光仅激发样品焦面附近信号，避免激发离焦信号，如多光子显微成像技术[19]、光片照明显微成像技术[20]、全内反射显微成像技术[21]等；另一种是通过物理阻挡、解调或去卷积算法实现对离焦信号的去除，留下焦面上的清晰信号，如共聚焦显微成像技术[22]、结构光照明显微成像技术[23]、动态散斑照明显微成像技术[24]、HiLo显微成像技术[25]等。相关的研究证明了HiLo 显微成像与共聚焦显微成像技术的光切片能力相当，但前者全视场光切片成像速度明显优于后者，原则上仅受相机曝光时间的限制，此外，HiLo 显微镜仅需要消散斑装置和相干照明光源（如激光）即可低成本地实施[25]，且与常规荧光显微镜具有良好的兼容性。

因此，针对现代生物学和生物医学领域对生物样品进行大视野、高分辨率的跨尺度观测需求，以及现有高空间带宽积显微成像系统存在体积庞大、实施成本高昂等问题，本文基于HiLo光切片技术和自主设计的大视场高分辨显微物镜，研发了具有高空间带宽积特点的大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统，测试了系统的成像视场和分辨率，开展了生物样本成像实验，旨在展示该系统具有兼顾大视场和高分辨率成像的优势和快速光切片成像的能力，能够对大体积生物样本开展快速三维成像，为胚胎发育、脑成像、数字病理诊断等研究提供有力的技术支撑。

2 方法及原理

2.1 HiLo光切片技术

HiLo光切片技术最早由Mertz等人提出，其中，“Hi”和“Lo”分别代表焦面高（High）空间频率和焦面低(Low)空间频率分量。该技术需对样本采集一幅散斑照明图像Is和一幅均匀照明图像Iu（包含焦面高频信息、焦面低频信息和离焦信息），然后对Is和Iu的差分图像进行对比度评价，得到加权函数，以此函数作为Iu中焦面信息的比例，将低通滤波器应用于加权的均匀照明图像，得到Iu中的焦面低频分量，然后，将互补的高通滤波器应用于Iu，获得焦面高频分量，最后，将二者加权融合，得到光切片图像[25-26]。相应算法的流程如下：

首先，计算散斑照明图像和均匀照明图像的差分图像δI的 散斑对比度Cδs(z)，Cδs(z)在样本对焦时达到峰值，而在样本离焦时衰减为零，因此可以用于区分均匀照明图像中焦面信息和离焦信息，具体表达式为[26]：

其中，As是 散斑颗粒的平均横向面积， OTFdet(k,z)是显微系统光学传递函数， OTFill(k,0)是照明光学传递函数，W(k)是通过两个高斯低通滤波器相减生成的带通滤波器，用于加速Cδs(z)离焦衰减，

其中，k是空间频率，σ是带通滤波器的标准偏差。仿真实验已经证明，光切片能力（即系统轴向分辨率）与σ成反比[26]。系统的轴向分辨率与其三维点扩散函数相关，可通过显微物镜焦深计算公式确定系统的轴向分辨率理论值，进而估计σ。

以上述散斑对比度Cδs(z)为加权函数得到均匀照明图像中焦面信息的比例，将低通滤波器LP(k)应用于加权的均匀照明图像，得到均匀照明图像中的焦面低频信息ILP为

进一步，将高通滤波器 HP(k)=1-LP(k)直接应用于均匀照明图像，得到互补的焦面高频信息，即

最后，由上述两幅图像加权融合得到HiLo 光切片图像，即

其中，η是一个缩放函数，用于补偿实际成像中散斑对比度通常不等于 1的情况，确保低空间频率到高空间频率的平滑过渡。η可以通过以下公式计算，

实践中，高通滤波器和低通滤波器的分割频率kc可 以按照kc=0.18σ估计[26]。

2.2 大视场高分辨显微物镜

显微成像系统的视场和分辨率主要由显微物镜决定。根据瑞利判据和显微物镜焦深计算公式，显微物镜的横分辨率 ε和轴向分辨率zmin分别为

式中，λ为工作波长，n为 物方介质折射率，NA为显微物镜的数值孔径。若显微物镜工作波段为可见光波段，为保证系统横向分辨率达到亚微米级，显微物镜数值孔径至少为0.49。据此，设计了大视场高分辨显微物镜，其参数如表1所示。

表1 大视场高分辨显微物镜设计参数Tab. 1 Design parameters of the wide-field-of-view and high-resolution objective

大视场高分辨显微物镜光学采用无限远共轭距结构，初始结构采用传统显微物镜的8组11片镜片结构形式，通过改变各个镜片的曲率半径与间距、选择特殊玻璃材料以及控制镜头组的光焦度等一系列手段，对像差进行优化校正，得到满足性能要求的光学设计，如图1（彩图见期刊电子版）所示。图1（a）像差曲线表明，物镜的球差和慧差控制良好；图1（b）轴向色差曲线表明，各波长的光在0.85归一化光瞳坐标下几乎交于一点，表明良好地校正了轴向色差，实现了复消色差；图1（c）场曲和畸变曲线表明，该镜头满足平场条件，最大畸变小于1%；图1（d）MTF曲线图表明，全视场全波段的MTF接近衍射极限，在1 000 lp/mm处MTF达到0.2，物镜设计良好。

图1 大视场高分辨显微物镜光学设计评价图Fig. 1 Design evaluation graphs of the wide-field-of-view and high-resolution objective

2.3 大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统

基于HiLo光切片技术和大视场高分辨显微物镜设计了大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统，系统光学原理如图2所示，其主要由激光光源模块、落射式照明模块、白光照明模块和成像模块等组成。激光光源模块由波长为488 nm和561 nm的双色激光器、消散斑装置和光纤耦合器构成，消散斑装置基于多模光纤振动的方法抑制激光散斑，通过控制消散斑装置中音圈电机模组振动的关闭/开启，获取散斑照明激光和均匀照明激光。落射式照明模块由光纤耦合器、两套4f中继镜组和光阑构成，用于将激光光源模块传导过来的激光光束准直、扩束、会聚、再准直，最后，形成平行光照亮样品面。白光照明模块由白光LED光源、科勒照明光路构成，用于为显微系统提供合适的白光照明光源。成像模块由轴向电动精密位移台、二维载物台、大视场显微物镜、荧光滤光器模组、反射镜、管镜、大靶面相机构成。其中，荧光滤光器模组由488 nm荧光滤光器和561 nm荧光滤光器构成，它们可以切换至成像模块主光路中，每一组荧光滤光器由对应的激发光滤光片、二向色镜、发射光滤光片构成。成像模块用于接收样品的透射光和荧光信号，实现明场成像或荧光成像。

图2 大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统光学原理图Fig. 2 Schematic diagram of wide-field-of-view and high-resolution HiLo optical sectioning microscopy system

为了匹配大视场显微物镜的空间带宽积，需选用大靶面科学级相机（sCMOS），根据奈奎斯特采样定理，探测器对角线方向需要的像素数为6 mm/(0.98 μm/2)＝12 245。因此，选用韩国LAON PEOPLE公司LPMVC-CXP151M面阵相机，像素为14 192(H)×10 640(V)，像元大小为3.76 μm×3.76 μm，全分辨率帧率为6 frame/s。由于该相机数据通量高达0.9 GPixel/s，为其配备了高速数据采集卡。高速数据采集卡型号为以色列KAYA Instruments公司的Komodo CoaXPress 4CH，具备4个CoaXPress接口通道，每个通道数据传输速度为6.25 frame/s。此外，根据大视场显微物镜和大靶面相机参数，匹配设计了成像管镜，焦距为444 mm。

基于上述原理研发了大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统，实物照片如图3所示。相较现有商业显微镜几兆（Million，M）至几十兆的空间带宽积，本系统空间带宽积高达151 M，系统参数如表2所示。系统具备3种成像模式：（1）白光照明的明场成像；（2）均匀激光照明的宽场荧光成像；（3）散斑和均匀激光混合照明的HiLo光切片成像。

图3 系统实物照片Fig. 3 Photo of the system

表2 系统参数Tab. 2 Parameters of the system

综上，HiLo光切片显微成像系统与落射式荧光显微镜类似，只是在照明路径中增加了激光束和消散斑装置，以形成散斑照明和均匀照明光。当消散斑装置处于静态时，在样品面上形成散斑照明；当消散斑装置工作时，产生的散斑在相机曝光过程中变得模糊，有效地在样品面上形成了均匀照明。对采集的散斑照明图像和均匀光照明图像进行处理，得到HiLo光学切片图像。

3 系统性能测试

3.1 成像视场测试

利用大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统对Thorlabs公司测试靶标R1L3S5P进行白光照明明场成像，开展系统成像视场测试实验，测试结果如图4所示，其中，图4(a)为横向视场测试结果，图4(b)为纵向视场测试结果。由图4可知，系统的横向视场H约为4.8 mm，纵向视场V约为3.6 mm。计算可得，系统的对角视场

图4 系统成像视场测试结果图Fig. 4 The test results of FOV of the system

3.2 分辨率测试

利用大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统对经过标定的星点直径为 Φ 200 nm的星点板进行白光照明明场成像，开展系统横向分辨率测试实验。在采集的星点图像上随机选取15个星点像，对其横向光强分布进行高斯拟合，得到横向光强分布半峰全宽（Full Width at Half Maximum，FWHM），FWHM取平均值后，由以下公式计算得到系统横向分辨率ε，即

式中，dx是相机像元大小，X是大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统的放大倍率。

系统横向分辨率测试结果如图5（彩图见期刊电子版）所示。图5（a）是200 nm星点板白光照明明场成像结果，图5（b）是随机选取的15个星点像横向光强分布曲线，图5（c）是15个星点像横向光强分布高斯拟合曲线的FWHM。FWHM平均值为2.19 pixel，相机像元尺寸为3.76 μm，系统放大倍率设计值为11.1×，由式（9）计算得到系统的横向分辨率为0.74 μm。

图5 系统横向分辨率测试结果图Fig. 5 The test results of lateral resolution of the system

利用大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统对2 μm绿色荧光聚甲基丙烯酸甲酯微球（无锡瑞格生物科技有限责任公司，型号UniFlu PMMA-0202G，以下简称“荧光微球”）进行三维光切片成像，开展系统轴向分辨率测试实验。将稀释后的荧光微球溶液用浓度为6%甲基纤维素凝胶固定在培养皿中，然后将培养皿固定在样品台上。在488 nm激发光照明下，系统以0.3 μm的运动步长对荧光微球样品轴向（Z向）扫描成像，共采集50层图像，每层图像包含一幅散斑照明荧光图像和一幅均匀照明荧光图像。

利用HiLo光切片算法处理每层散斑照明图像和均匀照明图像，得到50层荧光微球光切片图像，合成为荧光微球三维光切片图像。在三维光切片图像中随机选取15个荧光微球，对其光强分布进行去卷积处理，排除荧光微球直径对测量结果的影响，得到系统三维点扩散函数（Point Spread Function, PSF），然后对三维PSF轴向光强分布进行高斯拟合，得到FWHM，FWHM取平均值后，结合电动精密位移台运动步长dz计算得到系统轴向分辨率zmin，即

系统轴向分辨率测试结果如图6（彩图见期刊电子版）所示：图6（a）是荧光微球部分Z平面的荧光图像，图6（b）是随机选取的15个荧光微球去卷积后得到的三维PSF轴向光强分布曲线，图6（c）是三维PSF轴向光强分布高斯拟合曲线的FWHM。FWHM平均值为13.87步（step），由式（10）计算得到系统轴向分辨率为4.16 μm。

图6 系统轴向分辨率测试结果图Fig. 6 The test results of the axial resolution of the system

综上，系统成像视场测试值为6.0 mm，与设计值一致；系统横向分辨率测试值为0.74 μm，轴向分辨率测试值为4.16 μm。

4 生物样本成像实验

4.1 小鼠脑切片明场成像实验

利用大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统对苏木精-伊红(HE)染色的小鼠脑冠状切片开展白光照明明场成像实验，并与成像视场相近的OLYMPUS显微镜BX50（配备PLN4X物镜：NA，0.1，FOV，Φ5.5 mm）和分辨率相近的OLYMPUS显微镜BX50（配备PLN20X物镜：NA，0.4；FOV，Φ1.1 mm）成像结果对比，成像结果如图7（彩图见期刊电子版）所示。图7（a）是大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统的成像结果，图7（b）是成像视场相近的OLYMPUS显微镜成像结果，图7（c）是分辨率相近的OLYMPUS显微镜成像结果。图7表明，大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统与成像视场相近的OLYMPUS显微镜相比，具有更高的分辨率；与分辨率相近的OLYMPUS显微镜相比，具有更大的成像视场。因此，系统具有兼顾大视场和高分辨成像的优势。

图7 HE染色的小鼠脑切片白光照明明场成像结果对比图Fig. 7 Comparison of brightfield imaging results of a HEstained mouse brain slice illuminated by white light

4.2 小麦种子荧光切片三维光切片成像实验

利用大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统对异硫氰酸荧光素-小麦胚芽凝集素(FITCWGA)染色的小麦种子切片开展三维（Three-dimensional，3D）光切片成像实验。被测样品体积约为4.2 mm×3.6 mm×0.1 mm，激发光波长为488 nm，激光器功率约为50 mW，样品平面上的光功率密度约为1.2 mW/cm2，相机曝光时间设为500 ms，以2 μm的运动步长对样本进行轴向（Z向）扫描

成像，共采集50层100幅图像（每层采集一幅散斑照明图像和一幅均匀照明图像）。利用HiLo光切片算法处理每层采集的散斑照明图像和均匀照明图像（即宽场荧光图像），得到50层图像切片，将所有切片合成为三维光切片图像栈，相应的均匀照明图像切片合成为三维宽场图像栈，成像结果对比图如图8（彩图见期刊电子版）所示。图8（a）和8（b）分别是三维光切片图像栈和三维宽场图像栈全视场XY平面均值投影图，图8（c）和8（d）分别是三维光切片图像栈和三维宽场图像栈局部视场XY平面均值投影图，图8（e）和8（f）分别是三维光切片图像栈和三维宽场荧光图像栈局部视场XZ平面投影图。图8表明，大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统具有显著的光切片能力，在对厚样本成像时，能够有效抑制传统宽场荧光成像时的离焦信息，提高图像的横向分辨率和轴向分辨率。

图8 FITC-WGA染色的小麦种子荧光切片三维光切片成像和三维宽场荧光成像结果对比图（50层图像切片，单层图像切片厚2 μm）Fig. 8 Comparison of 3D optical sectioning and wide-field fluorescence imaging results of a FITC-WGAstained wheat seed fluorescence slice (50 slices,2 μm thick of every slice)

此外，系统对小麦种子荧光切片50层图像的采集共计耗时约150 s（包含轴向精密位移台的运动时间和图像存储时间），这表明，大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统能够对大体积生物样本开展快速光切片成像。

5 结 论

现代生物学和生物医学领域迫切需要大视场、高分辨率的显微成像技术和仪器对生物样品进行兼顾“全局形态”和“细节特征”的跨尺度观测，以满足重大科学问题的研究需求。受限于系统的空间带宽积，传统商业显微镜无法满足这一需求，且现有高空间带宽积显微成像系统存在体积庞大、实施成本高昂等问题。本文基于HiLo光切片技术和自主设计的大视场高分辨显微物镜，研发了具有高空间带宽积特点的大视场高分辨显微成像系统，测试了系统的成像视场和分辨率，应用该系统对小鼠脑切片开展了白光照明明场成像实验，并与成像视场和分辨率相近的OLYMPUS显微镜成像结果做了对比，同时，应用该系统对小麦种子荧光切片开展了光切片成像和宽场荧光成像对比实验。实验结果表明, 大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统的成像视场为4.8 mm×3.6 mm(对角视场6.0 mm)，横向分辨率为0.74 μm，轴向分辨率为4.16 μm。大视场高分辨HiLo光切片显微成像系统具有兼顾大视场和高分辨率成像的优势和快速光切片成像的能力，能够对大体积生物样本开展快速三维成像，将为胚胎发育、脑成像、数字病理诊断等研究提供有力的技术支撑。