大鼠脂肪组织石蜡切片制作及免疫组织化学显色方法*

于 畅 李 梁 张立佳 郝文静 张起帆 于 源 董自豪

（包头医学院，1 基础医学与法医学院人体解剖学教研室，2 医学技术与麻醉学院18级放射学专业，3 第三临床医学院19级临床医学专业，包头 014040）

哺乳动物体内的脂肪组织可分为白色脂肪组织（white adipose tissue，WAT）和棕色脂肪组织（brown adipose tissue，BAT）。白色脂肪组织与棕色脂肪组织拥有不同的代谢特征。白色脂肪组织主要分布于皮下、肾周、肠系膜等部位，其功能是储存甘油三酯。棕色脂肪组织则能通过非战栗产热消耗甘油三酯。近年来，白色脂肪组织向棕色脂肪组织转变的研究成为热点。2种脂肪组织均由大量脂肪细胞簇拥而成，细胞内富含大量脂质成分的脂滴。这种特殊的结构导致经常规脱水、透明、浸蜡程序处理的脂肪组织难以与石蜡融合，质地松软，导致切片不完整，存在大量的空洞、破碎，难以切出合格的切片。解偶联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）作为棕色脂肪组织的特征性蛋白[1]。本研究选取UCP1在大鼠脂肪组织中的表达来检测制片程序对免疫组织化学显色是否有影响。笔者摸索出一套大鼠脂肪组织石蜡切片制作及免疫组织化学显色的具体方法，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂

8周龄雄性SD大鼠共10只，平均体质量321～400 g，由斯贝福（北京市）生物科技公司供应，检验合格证号为SCXK（京）2019-0010。

抗-UCP1抗体购自Abcam，货号ab209483；通用二步法免疫组织化学试剂盒（小鼠/兔增强聚合物法检测系统）购自中杉金桥，货号PV-9000。

1.2 取材

取材前禁食不禁水12 h，水合氯醛麻醉，解剖大鼠，分离腹股沟区白色脂肪组织及肩胛区棕色脂肪组织。生理盐水清洗脂肪组织，滤纸吸干表面水分。

1.3 脂肪组织的固定、脱水、透明、浸蜡

将较大块脂肪组织用取材刀分割成小块，放置于中性福尔马林溶液中，固定12 h。用取材刀，将脂肪组织分割成3 mm×3 mm×2 mm小块，每4～5小块放置于一个微孔塑料包埋框中。依次用梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，石蜡浸蜡。笔者改良前后各步骤时间如表1。

表1 改良前后脱水、透明及浸蜡程序设定的比较

1.4 脂肪组织的包埋

用酒精灯将眼科弯镊预热数秒，将脂肪小块从包埋框中夹出，把脂肪小块放在石蜡包埋机工作台的加热板上，利用加热板的温度使石蜡和脂肪组织中的脂滴仍呈液态，接着用弯镊在脂肪小块上从上到下、从左到右来回轻柔地均匀挤压，尽可能将脂肪小块中的脂滴挤出。包埋模具提前在加热板上预热，迅速将处理好的脂肪制作成蜡块。

1.5 脂肪组织石蜡切片、H-E染色

将包埋好的蜡块修切好后用切片机切片，切片厚度 5 μm，摊片机水槽内温度控制在40℃左右，烤片机温度为60℃，烤片时间不少于1 h。H-E染色，环保中性树胶封片。

1.6 免疫组织化学显色

将切片常规脱蜡、脱水；TRIS-EDTA缓冲液抗原修复；抑制内源性过氧化物酶；滴加抗-UCP1抗体（1∶5 000），4℃孵育至次日；PBS冲洗，滴加二抗试剂，室温孵育10 min；DAB显色，镜下观察显色程度；苏木精复染，镜下观察细胞核着色；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2 结果

2.1 2种程序处理的脂肪组织切片及H-E染色比较

改良程序组蜡块质地均匀，组织完整，呈白色及棕色半透明状，切片时能连成完整蜡带，切片无空洞、破碎，组织无褶皱、无裂缝。H-E染色后镜下可见：白色脂肪组织细胞结构完整，染色清晰，核质分明，透明度好，无挤压褶皱现象；细胞内呈大空泡状，细胞核呈椭圆形或类圆形，偏离在边缘一侧，细胞团聚集呈蜂窝状；棕色脂肪组织形态完整，染色清晰，较白色脂肪组织的细胞排列更为紧密、细胞内有较多小空泡，细胞基质发达，细胞周围有较多血管（图1 A1、B1、C1、D1）。

传统程序组肉眼可见蜡块完整，与改良组无显著区别，但切片时较为困难，不易连成蜡带，切片不完整，存在大量的空洞、破碎，切片上组织存在褶皱、裂隙。有的切片看不到组织。H-E染色观察到白色脂肪组织细胞团整体结构较为凌乱，存在较多裂隙，细胞核类圆形，清晰可见，部分细胞膜不完整。棕色脂肪组织结构不完整，中央有较多裂缝、空洞，完整部分细胞结构尚清晰（图1 A2、B2、C2、D2）。

2.2 2种脂肪组织改良程序组石蜡切片免疫组织化学显色

免疫组织化学显色中，传统程序组在清洗过程中偶有脱片，改良程序组2种脂肪组织未出现脱片。镜下观察可见，改良程序组背景清晰，细胞膜完整，细胞核清晰可见，白色脂肪组织可见个别棕色点状颗粒，棕色脂肪组织于细胞内可见大量棕色斑块的阳性表达，满足科研需求（图2 A1、B1）；而在传统程序组，细胞结构紊乱，细胞膜结构不完整，切片出现裂隙空洞，染色有非特异假阳性斑块（图2 A2、B2）。

图1 2种程序处理的脂肪组织切片及H-E染色。A1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2：H-E染色，×400，标尺=100 μm；A1、B1：改良程序组白色脂肪组织H-E染色；C1、D1：改良程序组棕色脂肪组织H-E染色；A2、B2：传统程序组白色脂肪组织H-E染色；C2、D2：传统程序组棕色脂肪组织H-E染色.图2 2种程序处理的脂肪组织UCP1免疫组织化学显色，×400 ，标尺=100 μm。A1：改良程序组UCP1在白色脂肪组织中的表达；A2：传统程序组UCP1在白色脂肪组织中的表达；B1：改良程序组UCP1在棕色脂肪组织中的表达；B2：传统程序组UCP1在棕色脂肪组织中的表达.

3 讨论

白色脂肪组织与棕色脂肪组织形态学及代谢特征均不同，其对健康的影响也截然不同。白色脂肪组织容易堆积，与肥胖症、高脂血症、糖尿病有着密切联系；而棕色脂肪组织则能通过产热消耗脂肪，对控制体脂、预防疾病有着积极的作用。近年来，白色脂肪组织向棕色脂肪组织转化的研究成为热点。

对于脂肪组织的形态学研究，普遍采用石蜡包埋切片染色技术，石蜡切片制作过程中可脱去细胞中脂质成分，能很好的观察脂肪细胞形态，准确地定位抗原，并且石蜡切片能长期保存。也有学者采用冰冻切片的方法处理脂肪组织，但脂肪组织几乎不含水分，脂质成分不易结冰，难以像其他组织被冻硬，快速冰冻产生的冰晶也会对组织结构造成破坏，影响抗原定位，且冰冻切片不易长期保存，故冰冻切片在临床诊断上应用较多，但在科研领域有较多局限性[2-3]。

棕色脂肪组织区别于白色脂肪组织就在于其非震颤自主产热功能，从分子水平则表现为更高的UCP1表达量和耗氧量。换而言之，UCP1的表达量也决定着这种脂肪组织产热功能的水平。UCP1通过引起线粒体氧化呼吸链的电子传递和ATP生成之间解偶联，降低脂肪酸氧化代谢的产能效率，进而实现棕色脂肪细胞释放热量的功能[4]。UCP1为经典的棕色脂肪标志蛋白，因此选取UCP1在大鼠脂肪组织中的表达来检测制片程序对免疫组织化学显色是否有影响。

全部10只大鼠脂肪组织石蜡包埋后切片H-E染色和免疫组织化学显色，镜下观察并采集图像。所有H-E染色图像细胞结构清晰，核质着色良好，无挤压和皱缩现象。2种脂肪组织特征明显，易于分辨。免疫组织化学显色中，细胞结构完整，细胞核清晰可见，白色脂肪组织未见明显阳性表达，棕色脂肪组织呈阳性表达。结果表明笔者所述的大鼠脂肪组织石蜡切片制作方法是成功的。

大鼠脂肪组织石蜡切片制作的成功与否关键技术难点有3个方面。①取材：相对于大块脂肪组织而言，较小的组织块更易于乙醇、二甲苯、石蜡完全渗透进入组织，在多次使用传统大小组织块（2.0 cm×1.0 cm×0.3 cm）失败后，笔者将脂肪分割成3 mm×3 mm×2 mm小块，多个小块放于一个包埋框中，最后制成一个蜡块。较小的组织块能得到较好的脱水、透明以及浸蜡效果，也不会影响后续观察。②固定：固定一定要彻底，这是制备各种病理切片都至关重要的步骤。固定液至少为脂肪组织体积的50倍，用纱布覆盖以避免脂肪组织因悬浮在液体表面而造成固定不全。固定的目的是为了防止组织的自溶与腐败，以保持组织或细胞原有的结构。良好固定的组织呈一定的硬化状态，增加了组织的韧性，而且不易变形，有利于后续的脱水、透明、浸蜡、包埋及切片。彻底的固定可以更好的保证细胞膜的完整性，这在一定程度上可延长组织的脱水时间，并且在乙醇脱水、二甲苯透明及浸蜡的过程缓慢而温和，不会过于剧烈而引起组织的变形。固定时间也不宜太长，时间太长可能会造成抗原性丢失，固定时间以12 h为宜。③脱水、透明及浸蜡：传统上认为细胞中的脂滴容易被乙醇、二甲苯等有机溶剂溶解，但近年来有研究表明：相对于乙醇，二甲苯有着更好的溶解置换脂滴的效果[5]。故此，笔者改良的脱水、透明、浸蜡程序中，大大延长了100%乙醇溶液脱水以及二甲苯透明时间，以求尽可能置换出脂肪细胞中的大量脂滴。并且，笔者参考文献[6-8]，在包埋前增加了使用眼科镊挤压脂肪块的步骤。在包埋前将脂肪小块放于石蜡包埋机加热板上，利用加热板上的高温使脂滴仍然呈液态，用乙醇灯预热眼科镊，接着在脂肪组织上轻轻适当地挤压，使在脂肪组织中不能置换掉的脂滴尽量地挤出。改良程序处理的脂肪组织中，脂肪细胞中的脂滴被乙醇充分置换，进而也能被透明剂二甲苯以及石蜡充分置换，进而达到支撑细胞的作用，从而也能使蜡块质地均一，脂肪组织较软；将脂滴完全置换，也能使组织块得到充分的硬化，有助于后期的石蜡制片。传统程序组中，脱水不尽，脂滴不能充分被置换，二甲苯则不能完全渗入，蜡液更不能完全渗入组织，达不到支撑组织的作用，组织较软，蜡块质地不均一，切片质量差，易出现组织破碎、空洞、重叠。

笔者改良的大鼠脂肪组织石蜡切片制片方法，通过改良组织脱水、透明、浸蜡程序以及包埋方法，在不增加微波热固定、丙酮脱脂等复杂处理的同时[9-10]，有效提高了制片质量，能满足后续研究需求，值得在科研领域推广。