甘草对大鲵血液细胞及皮质醇水平的影响

文/王文博 高静 陈莹 鲁义善

为研究甘草对大鲵血液细胞及应激激素水平的影响，对大鲵投喂甘草提取物后，检测了大鲵血液指标及皮质醇含量。结果显示，在各个采样期药物组血清杀菌活性都高于对照组。56d时，低剂量组每毫升血液淋巴细胞总数为（48.4±6.1）×106个，显著高于对照组（28.9±7.1）×106个（P＜0.05）。结果表明，投喂甘草提取物提高了大鲵血液杀菌活性、血液淋巴细胞总数以及白细胞吞噬活性，并在一定程度上抑制了血清皮质醇水平，增强了大鲵抗应激能力。

近年来，人们致力于探索可替代抗生素和化学药品的绿色天然药物，中医药农业成为研究热点，中草药对水产健康养殖的作用日益突显。甘草是常见中草药，在临床上具有多种功效，并可增强机体的非特异性免疫力，而机体的非特异性免疫系统是抵御外来病原入侵的第一道防线，可以对病原进行非特异性杀伤，比如免疫细胞里的单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、粒细胞等及免疫分子里的溶菌酶、补体、C-反应蛋白等，在机体抗病方面发挥着重要作用。因此，提取甘草有效成分并制成药饵，在养殖过程中加以合理运用，或可有效降低动物发病率。

中国大鲵（Andrias davidianus），在分类学上隶属于两栖纲（Amphibia），有尾目（Caudata），隐鳃鲵科（Cryptobrachidae），大鲵属（Andrias），也被称作娃娃鱼、孩儿鱼，是我国二级重点保护珍稀水生物种和濒危野生动植物国际贸易公约附录Ⅰ物种。为保护大鲵这一濒危物种，防止其种群衰减造成野生资源枯竭，我国在20世纪80年代出台了一系列相关政策，鼓励人工养殖大鲵，因此大鲵养殖业得到了蓬勃发展。但是养殖过程中的疾病也随之而来，给养殖者带来了经济损失。在大鲵疾病研究方面，国内外主要聚焦于大鲵病原及其引发的病症。不同病原可引发不同症状，从症状上可以对病原做出基本的判断，但有时不同病原也可以引发相同或相似症状，比如有些病毒和细菌均能引起大鲵肌肉或者组织出血，需要运用病理学、分子生物学等手段来做诊断。

大鲵病症及病原的分子生物学研究相对较多，但是血液学及应激反应的研究还有所欠缺。机体的神经、内分泌及血液循环系统是紧密关联的，分别产生效应物来传递信号，从而引发级联反应。长期的应激反应也可使机体免疫力下降，诱发疾病。因此，如果能找到对血液免疫细胞有激活作用并能有效抑制应激反应的药物，将大大降低大鲵的发病率。本研究在以往的工作基础上，选用甘草这种天然绿色植物，对其有效成分进行提取，投喂大鲵，研究了其对大鲵血液细胞及应激激素皮质醇水平的影响，将中医药农业理论引入大鲵健康养殖实践，对大鲵疾病的防控和研发绿色无公害渔药具有积极意义。

一、材料与方法

（一）实验材料

甘草购自甘肃省武威市，其根部切片后提取有效成分。大鲵购自陕西省汉中市大鲵人工养殖场，平均体重为（248.05±3.07）g，实验前在持续流动的山泉水养殖池中驯养1周，投喂杂鱼及配合饲料。嗜水气单胞菌购自某生物试剂公司。

（二）药饵的制备

采用水提醇沉法提取工艺对甘草多糖及甙类化合物进行粗提。简言之，甘草饮片置10倍量95%酒精中，60℃回流醇洗，除杂。酒精废液60℃旋转蒸发，回收。药渣经蒸馏水浸提、过滤、弃药渣。水提液加乙醇以4000r/min离心沉淀20min，弃上清，将离心所得浸膏蒸干，研磨成粉，4℃备存。将甘草粗提粉按0.5%和2%的质量分数与基础粉料混合，制成颗粒饵料。其中，基础粉料配比（占干物质）为：鱼粉30%、鱼油10%、豆粕20%、淀粉20%、麸皮15%、无机盐预混料4.5%、维生素预混料0.5%。

（三）分组及采样

同源同批大鲵被随机分配到6个水泥池（每个容积约300L）中，每个池50尾大鲵，中间用隔板隔开，用于平行实验。其中，血液学实验用3个池，分别为对照组、低剂量组和高剂量组，均避光处理；皮质醇实验用3个池，分别为对照组、低剂量组和高剂量组，均暴露于日光下，使大鲵处于光照胁迫状态。血液学实验和皮质醇实验的对照组均投喂无药饵料，低剂量组投喂0.5%甘草饵料，高剂量组投喂2%甘草饵料。

分别在投喂后第14d、28d、35d、42d、56d采样，每次每池取10尾。实验前进行对照组采样。采样时，用一次性医用注射器于尾静脉抽血。

（四）血液学检测

1.血清杀菌活性

方法参照Ainsworth，略做修改。0.5%盐水制备嗜水气单胞菌悬液，用分光光度计将浓度调整为106CFU/mL。50µL血清加入等量菌悬液中，22℃孵育5h之后，将混合液倍比稀释，不同稀释度各取10µL加于TSB上，28℃孵育过夜，计算平皿菌落数（Colony Forming Units，CFUs）。用50µL盐水代替50µL血清加入等量菌悬液作为阳性对照。结果用杀菌百分率表示：

杀菌百分率（Percentage Killing）＝（1-实验组CFUs/阳性对照CFUs）×100%

2.血液淋巴细胞计数

将少量抗凝血用Giemsa染液做30倍稀释，取1滴加于血球计数板（型号：XBK-25）上，显微镜下统计淋巴细胞数目，将结果换算为每毫升血液中所含淋巴细胞总数。

3.血液红细胞压积

将抗凝血装于压积管中置水平离心机，以2000r/min转速离心30min，取出压积管用标尺量出红细胞压积的长度占全长的百分比，即为红细胞压积值。

4.血液白细胞吞噬活性

取抗凝血以600r/min离心10min，收集白细胞层，用RPMI1640细胞培养液将浓度调整至105个/mL备用。实验菌株为嗜水气单胞菌，显微镜下计数100个白细胞中吞噬细菌的白细胞数，按下式求出吞噬百分率：

吞噬百分率＝（吞噬细菌的白细胞数/100）×100%

5.血清皮质醇水平

参照P i c k e r i n g方法用放免法（RIA）进行测定。

二、结果

（一）血清杀菌活性测定结果

投喂甘草提取物对大鲵血清杀菌活性的影响结果见图1。在各个采样期药物组杀菌活性都高于对照组，14d和56d时，高剂量组杀菌活性显著高于同期对照组（P＜0.05），分别为（68±26）%和（62±18）%。但杀菌活性不存在剂量依赖性，在28d和35d时，低剂量组杀菌活性高于高剂量组。

图1 投喂甘草提取物对大鲵血清杀菌活性的影响

（二）血液淋巴细胞计数结果

血液淋巴细胞计数结果见表1。56d时，低剂量组每毫升血液淋巴细胞总数为（48.4±6.1）×106个，显著高于对照组（28.9±7.1）×106个（P＜0.05），35d时，高剂量组为（47.2±7.7）×106个，显著高于对照组（26.4±7.3）×106个（P＜0.05）。

表1 投喂甘草提取物对大鲵血液淋巴细胞数量的影响

（三）血液红细胞压积实验结果

由表2可知，药物组和对照组红细胞比容值没有显著性差异，均超过40%，各组随时间变化不大。

表2 投喂甘草提取物对大鲵红细胞比容的影响

（四）血液白细胞吞噬活性结果

由表3可知，药物组血液白细胞吞噬活性都高于同期对照组，其中，高剂量组在35d和42d两次结果都显著高于对照组（P＜0.05），分别为（65.9±9.5）%和（66.9±8.1）%。

表3 投喂甘草提取物对大鲵血液白细胞吞噬活性的影响

（五）血清皮质醇水平结果

由图2可见，药物组和对照组皮质醇水平均有小幅波动，低剂量组后三次略高于对照组，但无显著差异。高剂量组曲线在对照组和低剂量组下方，每次采样期都是同期最低，其中，在28d高剂量组皮质醇浓度为（173.5±25.2）ng/mL，显著低于对照组（235.7±24.8）ng/mL（P＜0.05）。

图2 投喂甘草提取物对大鲵血清皮质醇水平的影响

三、分析与讨论

血液是动物体内循环最重要的组成部分，负责为机体运输养分和氧气，并且构成抵抗病原入侵机体的天然屏障，能反映出机体的生理性状和受环境变化的响应情况。因此，血液学参数是评估机体健康和营养状况及应激反应程度的重要指标。血清是血液自然沉淀后形成的上清液，里面富含各种免疫因子，如溶菌酶、补体、碱性磷酸酶、血清蛋白、超氧化物歧化酶等，它们在对杀伤外来入侵病原体方面发挥着重要作用。

本实验中，在各个采样期药物组血清杀菌活性都高于对照组，其中在14d和56d时，高剂量组杀菌活性显著高于同期对照组（P＜0.05），说明投喂甘草提取物对大鲵血清杀菌活性具有一定的增强作用。由于血清中含有多种免疫因子，因此杀菌活性是一个综合效应，可能是血清中一种或几种免疫因子被激活。有实验显示，甘草促进了尖吻鲈（Lates calcarifer）幼鱼血清过氧化氢酶（CAT）活性和血清溶菌酶（LZM）含量（P＜0.05），提高了尖吻鲈幼鱼免疫力和低温胁迫后的存活率。其他学者也发现甘草具有显著的抗菌特性，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等都有杀伤作用。甘草的杀菌作用可能归因于其含有的多糖、皂苷、生物碱、蒽、精油、有机酸等有效成分。

血液中除了血清外，还有红细胞、白细胞和血小板，由于红细胞可以携氧和运输养分，因此红细胞数量的多少可以反映出机体的营养健康状况。白细胞又包括淋巴细胞和各种粒细胞等，它们都参与免疫应答反应，因此白细胞的数量和活性直接影响机体的免疫应答水平。血小板的功能主要在于止血。本实验中，56d时，低剂量组每毫升血液淋巴细胞总数为（48.4±6.1）×106个，显著高于对照组（28.9±7.1）×106个（P＜0.05），35d时，高剂量组为（47.2±7.7）×106个，显著高于对照组（26.4±7.3）×106个（P＜0.05），说明甘草有效促进了淋巴细胞的增殖。而药物组和对照组红细胞比容值没有显著性差异，各组随时间变化不大。与本实验结果不同，有研究用18β-甘草次酸长期对大鼠（Rattus norvegicus）进行灌胃实验，发现大鼠的红细胞数量有所增加，这可能是实验动物和实验方法不同导致的结果不一致。

除了白细胞数量外，白细胞的活性，尤其是吞噬活性，也是反映机体免疫应答水平的重要参数，因为它能吞噬动物体内衰老和死亡的细胞以及大量的病原微生物。本实验中药物组血液白细胞吞噬活性都高于同期对照组。其中，高剂量组在35d和42d两次结果都显著高于对照组（P＜0.05），分别为（65.9±9.5）%和（66.9±8.1）%，说明甘草促进了白细胞的吞噬活性，提高了杀伤入侵病原体的效力。

大鲵适宜在避光安静的环境下生活，在皮质醇实验中，将大鲵暴露于光照下，使其长期处于胁迫状态，然后检测其血液皮质醇水平，用于评估其对环境胁迫的响应。它的理论依据是，环境胁迫和机体的内分泌系统有着十分广泛的联系，而机体的丘脑下部-垂体-肾间组织轴（HPI轴）则在这种联系中占有主导地位，机体受胁迫后会发生一系列的级联反应，由肾间组织产生最终效应物——皮质醇，并释放到血液中去。因此，血液皮质醇水平被认为是确认机体应激的十分灵敏信号。

皮质醇短期升高是机体的自然生理反应，对机体有正面作用，但是如果皮质醇长期处于高水平，则会对机体产生不良作用，比如免疫力下降、发育不良、内分泌紊乱、对病原敏感性升高等。本实验中，高剂量组皮质醇曲线在对照组和低剂量组下方，每次采样期都是同期最低，说明高剂量甘草有效抑制了大鲵受胁迫后血液皮质醇的升高。类似的，有研究表明，用发酵甘草投喂斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）后，在亚硝酸盐胁迫下，鱼体血液皮质醇的含量低于对照组，表明饵料中添加发酵甘草可有效缓解石斑鱼的应激反应。有关甘草抑制皮质醇升高的报道较多，且结论一致。

综上，从本实验结果来看，甘草能较好地促进大鲵血液杀菌活性、白细胞吞噬活性等，对免疫调控具有一定的促进作用。同时，甘草能有效降低大鲵胁迫后的应激反应，揭示其作为抗应激剂使用的可能性。然而，中草药在水产养殖中的应用还存在一些实际问题。比如，药理研究还比较薄弱，中草药成分复杂，具体是哪种成分发挥着功效，以及其内在机制是什么，都有待深入研究。另外，本实验为定性实验，在甘草的最佳使用剂量和疗程方面，也有待进一步探索。最后，由于中草药的产地、品种、采摘季节、入药部位以及提取方法等方面异同，也可能极大地影响着实验结果，因此在进行引用和比较时这些因素应该考虑到。