陆地棉株高相关基因GhGA20ox6 的克隆及功能初探

杨炳磊，许好标，李黎贝，冯震，刘林，喻树迅,4*

（1. 浙江农林大学林业与生物技术学院，杭州 311300；2. 浙江农林大学现代农学院，杭州 311300；3.江苏联发纺织股份有限公司，江苏南通 226000；4.中国农业科学院棉花研究所，河南安阳 455000）

赤霉素（Gibberellin，GA）作为植物六大激素之一，是一类四环双萜类植物激素，在植物的种子萌发、根冠伸长、茎伸长、叶片生长、开花结果等过程中都发挥重要作用[1-2]。 在高等植物中，多种酶参与了多步骤酶促反应的赤霉素生物合成和代谢过程，调控这些酶的编码基因能有效地调节赤霉素的合成代谢速率。 参与赤霉素合成代谢的酶有很多种， 其中GA2-氧化酶（GA2-oxidase,GA2ox）是植物GA 降解过程中的关键酶，可以将植物体内具有活性的GA、GA 前体及其中间产物分解失活，从而维持植物体内活性GA 的动态平衡[3-4]。GA3-氧化酶（GA3-oxidase,GA3ox）和GA20- 氧化酶（GA20-oxidase,GA20ox）作为植物活性赤霉素合成代谢途径中的关键酶，催化GA12和GA53转变为具有活性的GA1和GA4。 此外，GA3ox 和GA20ox 还受体内活性GA 的负反馈调节[5-7]。 在植物体内活性GA 信号转导中，赤霉素不敏感矮化基因GID1（gibberellin insensitive dwarf 1） 编码赤霉素受体， 与赤霉素结合使DELLA 蛋白聚集到SCFSLY1复合物上， 从而使DELLA 蛋白被泛素化降解， 激活下游的信号转导，影响植物的生长发育[8]。

植物赤霉素氧化酶家族属于2OG-Fe（Ⅱ）氧化酶亚家族[9-10]。 目前，对模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana） 赤霉素合成与代谢通路的研究已经比较深入，赤霉素代谢途径的相关基因已经被克隆鉴定[11-12]。 前人的研究表明，农作物绿色革命与赤霉素代谢途径的相关基因密切相关[13]。 在植物中，赤霉素能促进茎的伸长和植株增高。 在水稻中，沉默GA20ox 相关基因会影响水稻的茎秆长度，导致水稻出现矮化表型[14]。 Plackett 等[15]在拟南芥沉默GA20ox1、GA20ox2和GA20ox3，发现植株出现矮化现象， 生长发育受到影响。Mauriat 等[16]通过增强山杨幼苗赤霉素相关基因PttGID1.1和PttGID1.3的表达水平，发现这些基因可以促进幼苗体内的活性赤霉素的信号转导，从而促进山杨茎的伸长。 Boonkaew 等[17]对高、矮椰子树（Cocos nuciferaL.）中GA20ox同源基因CnGA20ox1和CnGA20ox2的表达量进行测定，发现在不同株高的植株中GA20ox基因表达量存在显著差异， 推断GA20ox基因影响植株高度。目前，在苹果[18]、荔波连蕊茶[19]、黄瓜[20]、大豆[21]等物种中也有关于赤霉素氧化酶基因的报道，表明GA20ox基因对植物的生长发育存在重要的影响。

株高是作物育种和栽培管理中重要的目标农艺性状之一。 植株过高易倒伏，从而使作物的产量降低； 适当矮化的植株有较强的抗倒伏能力，可提高作物群体的光能利用率，从而提高作物产量[22-24]。 陆地棉（Gossypium hirsutumL.）包含A、D 两个亚基因组，基因组序列已被公布[25-26]，可以利用生物信息学方法来分析陆地棉基因的功能。 目前研究发现，棉花GA20ox相关基因能促进体内活性赤霉素GA 的生成，可调节棉花耐盐和耐旱性，并且调控纤维的起始和伸长[27-29]，但对其在棉花株高发育中的作用的研究存在空缺。 因此，从分子水平上研究GA20ox 对陆地棉株高的影响具有重要的意义。 本研究从陆地棉标准系TM-1 中克隆到1 个株高相关的基因GhGA20ox6，检测其在陆地棉不同组织中的表达量，通过亚细胞定位、转基因拟南芥表型鉴定，初步分析其在棉花生长发育中的分子功能以及表达模式，为今后对该基因的功能研究及利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料与处理方式

陆地棉标准系TM-1 种植于浙江农林大学平山基地（杭州市临安区），选取根、茎、叶、顶芽、萼片、开花后30 d 的胚珠、花、雄蕊和雌蕊进行GhGA20ox6的组织特异性表达分析。

选用本氏烟 （Nicotiana benthamiana） 进行GhGA20ox6基因的瞬时表达分析， 材料种植于浙江农林大学人工气候室，环境条件：光照16 h/黑暗8 h，温度22 ℃，相对湿度为50%。

利用哥伦比亚型拟南芥进行遗传转化试验，材料种植于浙江农林大学人工气候室，气候室条件设置：温度25 ℃，光照16 h/ 黑暗8 h，相对湿度为50%。

1.2 载体与所用试剂

转基因表达载体pBI121、pBINGFP4 保存于本实验室。 从上海唯地生物有限公司购入大肠杆菌DH5α 感受态和农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101 感受态。RNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公 司。 载 体pMD18-T、MightyAmp 高 保 真 酶、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒、DNA 片段纯化试剂盒和荧光试剂TB GreenPremix Ex TaqTMII 购 于Takara 公 司（中国大连）。 从上海源叶生物科技有限公司购入2- 吗啉乙磺酸、 乙酰丁香酮和1/2 MS 固体培养基，引物的合成及基因测序由杭州有康生物科技有限公司完成。 本研究所用引物序列见表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3 RNA 的提取及cDNA 的合成

使用RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取1.1 中陆地棉TM-1 样品的RNA，通过反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA。

1.4 陆地棉GhGA20ox6 基因的克隆

利用已公布的拟南芥和水稻GA20ox 的蛋白序列作为参照，从CottonFGD（https://cottonfgd.org/）下载陆地棉全基因组数据库，构建本地Blast 数据库，搜索得到13 个候选基因；根据已公布的陆地棉转录组数据库分析得到在茎中表达量较高的GhGA20ox6基因， 通过GhGA20ox6-F和GhGA20ox6-R 这对引物， 从TM-1 茎中扩增GhGA20ox6的编码序列， 将得到的片段连接到pMD18-T 载体， 重组质粒转化到大肠杆菌DH5α， 保存测序正确的单克隆菌液以供后续试验使用。

1.5 GhGA20ox6 的生物信息学分析

利用MEGA 5.0 软件，采用邻接法构建系统进化树[30]，自展值设为1 000，其他参数为默认值。利用ExPASy[31]（https://web.expasy.org/protparam/）在线分析网站预测GhGA20ox6 蛋白的理化性质，包括蛋白质序列的长度、等电点以及分子质量。 将目的基因编码的氨基酸序列利用DNA MAN 进行序列比对分析。 利用SMART 在线网站（https://smart.embl-heidelberg.de/）预测GhGA20ox6 的保守结构域。

1.6 GhGA20ox6 的表达分析

1.7 GhGA20ox6 蛋白的亚细胞定位

利用引物GhGA20ox6-SF 和GhGA20ox6-SR 将目的基因片段连接到带有绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）基因的载体上，将构建好的过表达载体35S::GhGA20ox6-GFP转化农杆菌菌株GV3101。 根据本氏烟草瞬时转化法[32]，将农杆菌菌液注射到培养20 d 的烟草叶片中，然后在黑暗条件下培养24 h，恢复光照继续培养48 h，在LSM880 共聚焦显微镜（蔡司公司，德国）下观察烟草叶片细胞中的GFP 信号[33]。

1.8 转基因拟南芥阳性植株筛选

将1.7 中的GV3101 农杆菌菌液在28 ℃下培养至600 nm 处的吸光值（OD600）为1.2～1.6，5 000 r·min－1离心10 min 收集菌体，利用0.02%（体积分数） 的Silwet-77 渗透液重悬至OD600为0.9，通过农杆菌蘸花法[34]侵染去掉结荚角果的拟南芥45～60 s，暗处理培养24 h，培养拟南芥至成熟，收获T0种子。 在超净工作台中，将种子种植于含有卡那霉素的1/2 MS 固体培养基上，放置于4 ℃培养箱春化48 h，然后取出放置于人工气候室（光照16 h/ 黑暗8 h），保证拟南芥正常生长，待到长出真叶后移栽到土壤。 生长2 周后提取DNA 检测阳性植株。重复上述种植操作，直至筛选到T3纯合单株， 选择3 个独立转基因株系L1、L2 和L3， 移苗后18 d 和30 d 对这3 个株系进行表型鉴定。 移苗后18 d，取转基因拟南芥茎部用于检测分析GhGA20ox6下游基因GID1a、GID1b和GID1c的表达。

2 结果与分析

2.1 GhGA20ox6 基因的序列分析

GhGA20ox6位于D 亚组9 号染色体上，开放阅读框长度为1 155 bp， 编码384 个氨基酸残基，包括2 个内含子和3 个外显子。 GhGA20ox6蛋白包含1 个DIOX_N 结构域（位于第63～172氨基酸）和1 个2OG-Fe（Ⅱ）氧化酶结构域（位于第228～323 氨基酸，图1）。利用ExPASy 在线软件预测GhGA20ox6 蛋白的分子质量为42.32 ku，等电点为6.37。 筛选鉴定出13 个陆地棉GhGA20ox基因，系统发育分析发现GhGA20ox6与GhGA20ox5、GhGA20ox8、GhGA20ox13所编码的氨基酸序列具有较高相似性，位于同一个分支上（图2）。对这13 个候选基因编码的氨基酸序列分析发现，其编码产物均有与GA 底物结合的高度保守基序LPWKET，其中7 个编码产物有与结合2- 酮戊二酸相关的保守基序NYYPXCQKP（图3）[35]。

图1 GhGA20ox6 结构域分析Fig. 1 Conserved domains of GhGA20ox6

图2 陆地棉、水稻和拟南芥GA20ox 的系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of GA20ox in upland cotton, rice and A. thaliana

图3 13 个陆地棉GA20ox 的氨基酸序列比对分析Fig. 3 The amino acid sequences alignment of 13 GA20ox in upland cotton

2.2 GhGA20ox6 基因的空间表达模式分析

进一步研究GhGA20ox6的组织表达特异性发现，GhGA20ox6在茎中优势表达，而在胚珠与花中的表达量较低（图4），据此推测GhGA20ox6在茎的生长发育过程中发挥功能。

图4 GhGA20ox6 基因在陆地棉不同器官中的相对表达量Fig. 4 Relative expression levels of GhGA20ox6 in different organs in upland cotton

2.3 GhGA20ox6 蛋白亚细胞定位分析

在WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）在线软件上进行GhGA20ox6 蛋白亚细胞定位预测，结果显示其定位在细胞膜。 在本氏烟叶片细胞中瞬时表达GhGA20ox6 与GFP （绿色荧光蛋白，green fluorescent protein）融合蛋白，结果显示仅细胞膜有明亮的绿色分布（图5 A～C），而单独表达GFP 蛋白的细胞中绿色荧光在细胞膜与细胞核均有分布（图5 D～F），表明GhGA20ox6 蛋白是1个膜定位蛋白。

图5 GhGA20ox6 在本氏烟中的亚细胞定位Fig. 5 Subcellular localization of GhGA20ox6 in N. benthamiana

2.4 GhGA20ox6 基因在拟南芥中的功能验证

同时种植野生型和3 个T3转基因拟南芥株系（每个株系各50 株），发现野生型拟南芥在移苗后22 d 开始抽薹， 平均抽薹时间为移苗后25 d； 转GhGA20ox6基因拟南芥在移苗后18 d开始抽薹，平均抽薹时间为移苗后20 d，早于野生型（图6 和表2）。 转GhGA20ox6基因拟南芥株系的平均株高约为31 cm， 极显著高于野生型拟南芥（24 cm），莲座叶数量也极显著增加（表2）。GhGA20ox6和GID1基因在茎中的表达检测结果（图7）显示：转基因拟南芥中的GhGA20ox6高水平表达，符合35S 启动子驱动外源基因转入的情况；相对于野生型，转基因拟南芥中GID1a、GID1b、GID1c基因的表达量也均极显著上升。说明GhGA20ox6基因可增强GID1基因的表达，促进茎的生长。

图6 野生型拟南芥和转GhGA20ox6 基因拟南芥的表型Fig. 6 Phenotypes of wild type and transgenic%Arabidopsis

图7 转基因拟南芥中GhGA20ox6 和GID1 基因的表达水平Fig. 7 Expression level of GhGA20ox6 and GID1%genes in transgenic Arabidopsis%lines

表2 野生型和转基因拟南芥相关表型Table 2 Phenotypes of wild type and transgenic plants

3 讨论

GA20ox 对植物的生长发育和环境适应性起着重要的作用，是植物体内活性赤霉素合成的关键酶。 GA20ox 具有2OG-Fe（Ⅱ）氧化酶结构域，属于2OG-Fe（Ⅱ）双加氧酶[36]。 GA20ox 在赤霉素合成的第三阶段发挥作用，催化C20-GA 分子生成C19-GA 分子， 经过13- 羟基化以及13- 非羟基化这2 个途径生成GA5和GA12， 然后通过赤霉素信号转导调控植物的生长发育[37]。目前，在白毛杨[38]、水稻[14]等物种中关于过表达GA20ox使转基因植株变高的研究较多，表明GA20ox 能促进细胞伸长以及茎的生长。

拟南芥ga5突变体由于缺失AtGA20ox基因出现半矮化的表型[39]。 过表达AtGA20ox基因可以提高拟南芥中活性赤霉素的含量， 使植株变高、开花提前[40]。 Monna 等[41]通过图位克隆方法，发现水稻半矮化基因（semi-dwarfing gene）sd1（OsGA20ox2）编码GA20ox，水稻sd1突 变 体 呈现矮化表型。GhGA20ox6基因与OsGA20ox2基因的同源性较高， 推测可能行使相同的功能。本研究通过从陆地棉材料TM-1 中克隆得到1 个赤霉素氧化酶基因GhGA20ox6， 利用本地blast找到13 个GA20ox基因，经过多重序列比对，发现GhGA20ox6 蛋白序列具有与GA 底物结合的高度保守基序、与结合2-酮戊二酸有关的保守序列， 并且GhGA20ox6基因在TM-1 不同器官中的表达量差异较明显，在茎中表达量较高，推测GhGA20ox6基因主要在茎中发挥功能。

目前，GA20ox基因对纤维生长发育的影响研究报道较多，GhGA20ox1的过表达能促进棉花体内赤霉素的合成，影响赤霉素的信号转导过程，进而促进棉花纤维的伸长，对纤维的品质改良有现实意义。 Xiao 等[42]通过测定陆地棉突变体中GhGA20ox1以及GhGA20ox2的表达量发现，其在胚珠中的表达量较高，推测这2 个基因影响纤维发育的起始阶段。 López-Cristoffanini 等[43]研究水稻ga20ox突变体发现， 突变体节间的活性GA 水平明显低于正常型，导致节间长度缩短。棉花GA20ox基因对棉花株高性状的内在机理尚不明确，为进一步探究GhGA2ox6对陆地棉生长的影响，本研究通过转基因拟南芥试验，发现GhGA20ox6表达量的上升， 导致下游赤霉素受体基因GID1的表达量也上升， 株高增加， 推测GhGA20ox6参与棉花茎的生长发育，影响株高，为进一步研究赤霉素调控棉花株高提供了初步依据。

4 结论

从陆地棉材料TM-1 茎中克隆得到Gh-GA20ox6，编码产物定位于细胞膜，在TM-1 茎中优势表达，异源过表达该基因能显著提高拟南芥株高。GhGA20ox6还能促进转基因拟南芥中赤霉素受体基因GID1的表达， 推测GhGA20ox6对株高性状具有重要作用。 至于赤霉素信号转导途径如何调控植物株高的分子机制，有待于进一步研究。