5-氨基乙酰丙酸及其前体药物介导的光动力疗法在恶性肿瘤治疗中的应用研究进展

高艳霞，刘睿，刘南南，索玉平

山西医科大学第五临床医学院，太原030012

据报告显示，我国恶性肿瘤发病率和病死率均比全球平均水平高，严重影响我国居民的身心健康［1］，寻找一种有效的治疗方法至关重要。恶性肿瘤的治疗方法因肿瘤分期和部位而异，目前主要有手术治疗、放疗、化疗、免疫治疗、激素治疗和联合治疗等。每一种疗法都有其适应证和不良反应，对部分患者有效，但仍有许多患者出现不良结局［2］，因此，肿瘤的新型治疗方法始终是学者们研究的重点［3］。光动力疗法（PDT）是肿瘤治疗研究的热门，与传统治疗方法相比，它是一种相对非侵入性治疗，不良反应轻，可多次重复，对肿瘤细胞的选择性高。PDT 已经被用于皮肤科临床疾病的治疗，如光化性角化病、基底细胞癌等，但在其他系统恶性肿瘤治疗方面仍处于细胞水平、动物模型研究阶段，临床应用还较少。无论是临床应用还是基础研究方面，5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）介导的PDT（5-ALA-PDT）应用最为广泛。5-ALA 已于2007 年在欧洲和欧洲以外的国家获得批准，并于2017 年获得美国食品药品监督管理局的批准［4］。现就5-ALA 及其前体药物介导的PDT在恶性肿瘤治疗中的应用研究做一综述。

1 5-ALA-PDT的应用

1.1 治疗机制 5-ALA 是一种氨基酸，是植物和动物卟啉生物合成的前体［5］，由线粒体中的甘氨酸和琥珀酰辅酶A 在ALA 合成酶的催化下合成，在PDT中用作光敏剂。它是血红素生物合成途径中的中间体，进一步形成原卟啉Ⅸ（PpⅨ），经过一系列酶促反应，亚铁螯合酶最终催化亚铁插入PpⅨ形成血红素，血红素将启动负反馈机制调节ALA 合成酶的活性。这种负反馈调节可以被外源性5-ALA 绕过，进而导致细胞内PpⅨ的积累［6］。

PpⅨ作为一种天然光敏剂，直接从无害的可见光源吸收能量，随后把能量转移到氧分子上，产生单线态氧和其他活性氧物质，这种单线态氧被认为是细胞毒性物质，可与细胞成分（DNA、蛋白质等）快速反应，引起肿瘤细胞损伤，最终导致细胞坏死和（或）凋亡［7］。单线态氧的作用范围较窄（0.02 ～1 μm）且寿命较短（0.04 ～4 μs），使得PDT 杀灭肿瘤细胞的同时，不损害附近的正常组织细胞。此外，PDT 还能够破坏肿瘤微血管，使剩余的肿瘤细胞缺乏维持生存所必需的氧和营养物质；并能导致免疫原性细胞死亡，进一步激活免疫系统，有助于肿瘤的长期控制［8］。另外，有研究表明，5-ALA-PDT 可诱导CCL8 表达，CCL8 可刺激单核细胞和T 淋巴细胞的迁移，诱导抗肿瘤反应；还能够通过募集M1 型巨噬细胞放大ALA-PDT的疗效［9］。

5-ALA-PDT 的疗效与细胞内PpⅨ的蓄积相关。对5-ALA-PDT 敏感的细胞系表达PEPT1（一种ALA摄取转运蛋白），对5-ALA-PDT 耐药的细胞系表达ABCG2（一种PpⅨ输出转运蛋白）［10］。肿瘤细胞更倾向于通过糖酵解途径和乳酸发酵代谢（Warburg效应）而不是氧化磷酸化［11］，导致铁代谢异常和铁插入错误，PpⅨ到血红素的通路中断，致使肿瘤细胞中PpⅨ更多地蓄积。PpⅨ蓄积的原因可能为：肿瘤细胞特异性地摄取较多量的5-ALA或线粒体内的亚铁螯合酶活性降低［12］；在肿瘤细胞中，由于Warburg效应，为Fe3+还原为Fe2+提供的电子不足，导致PpⅨ无法转化为血红素［13］。

PDT 有效的主要原因包括：作为肿瘤复发转移的主要因素，休眠肿瘤细胞对多数化疗药物、放疗不敏感，但有研究表明休眠肿瘤细胞表现出卟啉代谢增加和对5-ALA-PDT 敏感［14］；肿瘤微环境与肿瘤发生、肿瘤进展和转移密切相关，肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的重要组成部分，影响肿瘤细胞的生物学行为，有学者提出5-ALA-PDT 对CAFs的活化具有抑制作用［15］；此外，PDT诱导的抗肿瘤免疫应答将有助于预防肿瘤复发［16］。

1.2 制剂类型 5-ALA 用于皮肤科疾病治疗时，最常用的剂型是乳膏、凝胶，如SHI等［17］的研究中所使用的光敏剂是5%的ALA 乳膏。在一项病例报告中，研究者使用10%ALA 乳膏介导的PDT 成功治疗1 例原位鳞状细胞癌患者，随访一年无复发［18］。有学者使用10% ALA 凝胶介导的PDT 成功治疗12 例躯干和四肢原位鳞状细胞癌［19］。5-ALA 也有口服药剂型，口服给药后，5-ALA 在肠道吸收较快，随后在胞质内摄取并代谢，启动酶促反应，增加PpⅨ的积累。此外，5-ALA 的舌下含服剂型也用于治疗口腔和咽部肿瘤的癌前病变。

1.3 治疗方案 5-ALA-PDT 是通过PpⅨ的产生来发挥作用的，将5-ALA 与细胞共同孵育或直接将其作用于机体时，5-ALA 生成PpⅨ的效率不仅与孵育时间、给药时间密切相关，而且受5-ALA 浓度、环境pH 影响。目前5-ALA-PDT 尚没有统一的标准治疗方案。FONTANA 等［20］研究了PDT 对胶质肉瘤细胞株的作用，发现5-ALA 低浓度和高浓度均不能产生有效的作用，在此研究中有效的最低浓度为125 μg/mL，最佳孵育时间为4～8 h，最佳的pH 为6.8 ～7.2；pH＞7.2时可能会存在5-ALA 聚集而导致活性丧失，pH 过低时则生成的PpⅨ过少，不足以起作用。5-ALA 用于荧光引导手术时，口服药物后最佳的等待时间为3～4 h。5-ALA 用于治疗皮肤科疾病时，涂抹药物与光照的间隔时间在1～3 h。在SACHSENMAIER 等［21］的研究中，浸润性导管癌骨转移细胞系和肾癌骨转移细胞系暴露于相同剂量的5-ALA，结果浸润性导管癌骨转移细胞系凋亡，而肾癌骨转移细胞系衰老，表明不同的细胞系对5-ALA 的敏感性是不一样的。

1.4 应用情况 5-ALA-PDT 在临床上已用于皮肤科疾病的治疗，技术相对成熟，其在其他系统恶性疾病中的应用目前还在基础研究阶段，但已经取得了一定的成效。VERMANDEL等［22］验证了5-ALA-PDT用于最大肿瘤切除后胶质母细胞瘤治疗的可行性和安全性，可能通过靶向杀灭瘤腔内残留的肿瘤细胞来降低复发风险。黏液纤维肉瘤是软组织肉瘤的一种亚型，局部复发率高。有学者成功将5-ALA 肿瘤涂料和PDT 用于人黏液纤维肉瘤细胞系MUGMyx1，结果显示，5-ALA 对恶性黏液纤维肉瘤细胞有选择性荧光标记和细胞毒性，同时保留了良性脂肪细胞［23］。研究者使用5-ALA-PDT 诱导了乳腺癌和肝细胞癌的细胞毒性和遗传毒性，同时表明，它有可能通过增强致突变性来诱导DNA 损伤，抑制肿瘤细胞增殖［24］。还有研究显示，5-ALA-PDT 在T 淋巴细胞白血病（ATL）等血液系统恶性肿瘤中可有效杀死肿瘤细胞而不损伤正常淋巴细胞，还可以去除标准化疗或免疫治疗后剩余的耐药ATL 细胞，这表明PDT 可以与常规治疗方式联合应用［25］。SCHWAKE等［4］也通过试验证实了5-ALA-PDT 在4 种儿童恶性神经系统肿瘤细胞系中的应用效果。

上述结果表明，5-ALA-PDT治疗恶性肿瘤有效，但5-ALA 的脂溶性差，这一缺陷限制了其通过细胞膜等生物屏障的能力，导致发挥出来的作用没有达到预想的效果。为了解决这个问题，目前许多研究者致力于将5-ALA 进行各种各样的修饰、包裹、偶联，进一步增强PDT的作用效果。

2 5-ALA前体介导PDT的应用

2.1 治疗机制 为了克服5-ALA 的缺陷，许多ALA 的前体药物被研发出来，以抵消ALA 本身的亲水性，增强在生理条件下的稳定性，并提高对肿瘤细胞的靶向性［26］。根据光敏剂发挥作用的过程，将5-ALA-PDT 人为地划分为三个步骤：5-ALA高效率地进入机体、特异性地靶向肿瘤组织或细胞、在肿瘤细胞内转化为PpⅨ，进而在光、氧的存在下发挥作用。5-ALA 前体药物就是通过分别或联合改进这三个步骤来设计的，即增强5-ALA的渗透性、提高5-ALA的肿瘤特异性、加强PpⅨ生成的高效性。

增强5-ALA渗透性的最简单及最初研究的方法是对其基团进行修饰，亲脂性酯如临床批准的甲酯（Metvix）和己酯（Hexvix）已被证明对增强ALA 摄取有效，但使用简单的ALA-酯在肿瘤特异性方面显示出了劣势。ALA-酯给药后，在所有细胞类型中引起药物的非特异性分布，这就引发了对5-ALA 的进一步研究。解决水溶性药物组织渗透性差问题的另一个方法是用脂溶性强的物质包裹，而自然界广泛存在的天然多糖（如壳聚糖、透明质酸、藻酸盐）就具有这个特性，目前临床研究较多的是透明质酸（HA）。HA 是人体中天然存在的组分，广泛分布于身体组织、细胞内液中，可通过不同途径排泄，其具有生物相容性、快速溶解性、生物降解性［27］等优点，这些特性使其能与5-ALA 结合进而提高5-ALA 的渗透性。此外，增强组织渗透性的方法还有使用促渗剂、离子导入、超声导入、生物诱导性药物、主客体复合物等，但关于这些方面的研究还较少。

增强肿瘤特异性的一个有效方法是施加仅在肿瘤部位触发治疗效应的外部刺激。许多研究者利用特异性表达于肿瘤细胞表面的抗原或受体，设计出了与受体特异结合的配体，将配体与5-ALA 通过各种方式组合，组合体就能特异性地到达肿瘤组织发挥作用。

PpⅨ的积累主要依赖于生成增多与消耗减少两个途径。生成增多主要依赖于上述两个过程，即5-ALA 高效率地进入机体且特异性地靶向肿瘤组织。PpⅨ的消耗途径是其与Fe2+在亚铁螯合酶的催化下合成血红素。因此，可以从减少Fe2+的供给及抑制亚铁螯合酶的活性出发来减少PpⅨ的消耗。

2.2 制剂类型 将5-ALA 与HA 组合制作成贴片，贴片与皮下注射针组装成微针就可以对皮肤病变进行治疗。微针可穿透皮肤、角质层的保护屏障，通过在皮肤中形成可逆性微通道，将5-ALA-HA 释放入病灶处，HA 快速溶解，剩余5-ALA 发挥作用。且微针插入引起的疼痛极小，因为微针的有限插入深度，不会刺激皮肤中的神经。

最近有研究者将5-ALA固定于纳米级脂质囊泡凝胶制剂中，形成BF-200 ALA 纳米乳剂凝胶。纳米乳剂BF-200可以增强ALA 对角质层的穿透力，是惟一在美国获批用于病灶和视野导向治疗的光敏剂［28］。也有将5-ALA 与壳聚糖、线粒体靶向药物偶联形成的纳米颗粒用于口腔癌小鼠模型治疗的研究［29］。

为了减少光敏剂脱靶激活的不良反应，研究人员将5-ALA 负载在等离子体双金属纳米颗粒上，纳米粒子上还负载有聚乙二醇以增强其生物相容性，负载特异性抗体以增强其靶向性。研究结果表明，合成的纳米颗粒较游离5-ALA具有显著的肿瘤杀伤作用［30］。

2.3 治疗方案 5-ALA 前体药物介导PDT 目前处于基础研究阶段，还未应用于临床。在这些研究中，研究人员首先通过各种方式制备、表征不同的前体药物，然后将这些药物做为实验组，游离5-ALA做为对照组作用于肿瘤细胞，检测前体药物的疗效，在整个实验过程中需保持其他变量如光源、光照参数的恒定。另外也可以将药物作用于不同的细胞类型以期扩展应用范围。不同类型细胞对药物的敏感性不同，故所得出的最佳实验方案也不尽相同。单独的肿瘤细胞不足以模拟体内的肿瘤微环境，有学者使用球状肿瘤模型来模拟肿瘤微环境，但因为缺乏细胞外基质和免疫细胞，无法确定5-ALA 前体药物介导的PDT 如何影响细胞间相互作用，因此需要进一步的动物模型及临床试验验证其有效性。总之，针对不同的前体药物、不同的细胞系，治疗方案都有所区别。

2.4 应用情况 ZHAO 等［31］在皮下小鼠肿瘤模型中验证了载5-ALA-HA 微针介导的PDT 的有效性，实验组（含ALA 0.61 mg）和对照组（含ALA 1.65 mg）的抑瘤率分别为97%、66%。另有研究人员制备得到5-ALA-HA 溶解微针（5-ALA@HAMN），其可以高效穿透皮肤屏障，溶解并将负载的5-ALA 释放到肿瘤部位，达到比5-ALA 溶液更好的治疗效果。此外，由于HA 的酸性和无氧环境，所制备的5-ALA@HAMN 在室温下表现出很好的长期稳定性和活性［13］。

针对增强5-ALA 的肿瘤特异性，学者们进行了如下探索。在一项研究中，研究者合成了一种新的肽靶向的5-ALA 树突状前体药物，这种药物在与归巢肽连接的核心结构上有9 个ALA 分子，可以靶向递送至特定的肿瘤细胞类型［26］。叶酸受体（FR）在多种类型肿瘤细胞过表达［32］，纳米粒子加入叶酸（FA），通过识别FR，增加了其选择性靶向肿瘤组织的能力。AKBARZADEH 等［33］成功制备了氧化铋纳米颗粒（Bi2O3NPs），然后与5-ALA 和FA 偶联，FA 通过识别肿瘤细胞表面的FR，介导FA-5-ALA Bi2O3NPs靶向人鼻咽癌细胞，纳米粒子通过内吞作用进入细胞，显著提高了PDT 的细胞杀伤作用。还有研究人员成功研制出两性离子屏蔽肽保护的PLGLAG 靶向的ALA 前体药物纳米载体，PLGLAG 可被肿瘤微环境中过表达的基质金属蛋白酶2 识别并裂解，载药的纳米颗粒的ALA 摄取率远高于对照组，光照射后活性氧生成增多，PDT效果更好［34］。

针对PpⅨ生成增多和消耗减少这两条途径，学者们对5-ALA 进行表征加工，并取得一定成果。WANG 等［35］通 过 体 内 外 实 验 表 明，其 研 制 的PB@PMO-5-ALA 可以通过增加PpⅨ和氧供应的积累来增强对胶质瘤的PDT 治疗效果。已知肿瘤细胞中的谷胱甘肽（GSH）浓度是正常细胞的2 倍以上，在一些耐药肿瘤细胞中，细胞内GSH 水平增加更加明显，且细胞外区域的GSH 浓度远低于细胞内区域。基于以上特点，有学者设计了一种GSH 反应性5-ALA 衍生物（SA），SA 在酸性、中性和碱性条件下均表现出显著的稳定性，在GSH 作用下能有效地释放5ALA-OMe。SA 诱导的PpⅨ与细胞内GSH 水平呈正相关，由于其高效的PpⅨ生成活性，SA 的光毒性增强［36］。有研究者将5-ALA与胆固醇天然前体角鲨烯共价偶联，发现角鲨烯-ALA 纳米颗粒在诱导人前列腺癌细胞PC3 和胶质母细胞瘤细胞U87MG产生PpⅨ方面非常有效［37］。LI 等［38］通过共包封5-ALA和去铁胺（DFO，铁螯合剂）进入膜融合脂质体，成功制备了MFLs@5-ALA/DFO，其可快速与肿瘤细胞膜融合，进行5-ALA 和DFO 共递送。MFLs@5-ALA/DFO 能高效降低Fe2+水平，从而阻断PpIX 向血红素的生物转化，实现天然光敏剂的积累；此外，随着Fe2+的减少，DNA 修复酶的活性也受到抑制，导致肿瘤细胞DNA 损伤难以修复，显著增强了PDT 的治疗效率。还有研究表明，羟基吡啶酮铁螯合剂CP94及新型的羟基吡啶酮铁螯合ALA 前体药物AP218可通过降低细胞内铁储备，使PpⅨ形成血红素的可能性降低，从而增加PpⅨ水平，肿瘤细胞对PDT 的效应更大，这些效应在人胎肺成纤维细胞MRC-5 和人上皮鳞状癌细胞A431中得到验证［39］。

近年来，恶性肿瘤的发病率、复发率、病死率逐年提高，现有的治疗方式虽然有一定疗效，但患者的生存结局并不十分理想。PDT的出现给常规治疗手段效果不佳的患者带来了希望。目前5-ALA-PDT对一些恶性肿瘤有显著作用，尤其是皮肤肿瘤，但其脂溶性低、肿瘤特异性差的缺点限制了它在其他系统肿瘤中的应用。为了克服这一障碍，研究者研制出了一系列5-ALA 前体药物，并在一些肿瘤细胞中证实了药物的疗效，这为PDT 的进一步临床应用奠定了基础。然而，肿瘤细胞缺乏肿瘤微环境，不能模拟完整的机体，故PDT 的确切效果需要进一步在动物模型及临床试验中进行验证，这是未来的研究方向。现有的光敏剂仍存在难以克服的问题，如不能穿透深层组织、脱靶释放等，需要进一步研究解决，这也是研究的难点。另外，也可以从光和氧这两个因素着手增强PDT 效果，使PDT 在临床上发挥更大的作用。