间充质干细胞来源外泌体治疗肾脏疾病的作用机制研究进展

张彦清，石浩，王家平

1 昆明医科大学附属昆明市儿童医院放射科，昆明650500；2 昆明医科大学第二附属医院放射科

肾脏疾病是世界范围内病死率增长的原因之一。各种原因所致的肾脏疾病可能进展到慢性肾脏病（CKD），尚无有效的治疗措施。间充质干细胞（MSCs）是一类具有自我更新和多分化潜能的成体干细胞，目前普遍认为MSCs 主要通过旁分泌作用发挥功能［1］，直径为40～100 nm 的囊泡是其重要传导媒介，这些囊泡被命名为外泌体。外泌体包含多种细胞质和膜蛋白，包括受体、酶、转录因子、细胞外基质蛋白、核酸和脂质。外泌体的功能广泛，除了参与细胞间信息交流，还具有转运RNA 和调节免疫应答的作用［2］。来源于MSCs 的外泌体通过将活性生物分子（如肽、蛋白质和RNA）封闭并输送到受损细胞或组织，从而促进组织再生［3］。近年研究表明，MSCs的修复肾损伤、保护肾功能的作用大多是通过旁分泌多种物质而实现。目前认为干细胞的旁分泌效应可能是治疗肾脏疾病的有效策略。现就MSCs来源的外泌体（MSC-Exo）治疗肾脏疾病的机制相关研究进行综述。

1 抑制细胞凋亡

细胞凋亡是一种特殊类型的细胞死亡，是由基因调控的单个细胞自我死亡过程，对于维持适当数量的细胞以及正常组织结构至关重要［4］。细胞凋亡早期阶段的特征是核染色质的紧缩和边缘化、细胞质的浓缩和核碎裂，随后形成凋亡小体，从而被正常细胞清除。凋亡在肾损伤中也起着关键作用，HARRISON 等［5］首先通过光学和电子显微镜观察发现人肾小球肾炎中存在凋亡小体，并认为一定的凋亡能使细胞增殖过多的肾小球恢复正常。研究表明，细胞凋亡是肾小球硬化过程中进行性细胞丢失的重要原因，肾小球凋亡细胞的数量随着肾小球硬化的进展而增加［4］。在狼疮性肾炎和IgA 肾病的肾小球中可见凋亡细胞积聚，并且肾小球硬化指数和凋亡指数与肾功能下降密切相关［6］。因此，如何避免肾固有细胞过度凋亡损伤一直是治疗肾脏疾病的关键。

研究表明，在大鼠体内移植MSC-Exo 可以降低血肌酐和尿素氮水平，并通过抑制细胞凋亡促进细胞恢复，减轻肾损伤严重程度［7］。ZHANG 等［8］也报道了MSC-Exo可减轻肾小管损伤，改善肾小管功能，减少细胞凋亡。类似研究表明，移植MSC-Exo 可减轻肾缺血再灌注肾缺血再灌注（IRI）诱导的急性肾损伤（AKI），并抑制肾小管上皮细胞凋亡和纤维化进程［9］。MSC-Exo 治疗后，顺铂诱导的AKI 大鼠肾组织中Bcl-2 蛋白、细胞色素C、活化的Caspase-3 表达减少，同时抗凋亡蛋白表达水平增加［10-11］。还有研究报道，MSC-Exo 可能通过作用于miR-199a-3p，下调IRI 小鼠肾脏组织中Bax、Caspase-3 和信号素Sema3A 的表达，抑制肾细胞凋亡［12］。BRUNO 等［13］也发现，MSC-Exo 可诱导抗凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2 和BIRC8 的表达，下调促凋亡基因Caspase-1、Caspase-8 和LTA 的表达，从而在IRI 模型中促进肾细胞存活。另外，MSCs 外泌体中富含特定的mRNA（CDC6、CDK8 和CCNB1）及肝细胞生长因子和类胰岛素生长因子，可以在阻断凋亡的同时诱导肾小管上皮细胞进入细胞周期和增殖［14］。上述结果表明，MSC-Exo通过减少细胞凋亡来治疗肾脏疾病。

2 减轻氧化应激

氧化应激是氧化系统和抗氧化系统之间不平衡的结果，是由于自由基产生过多或抗氧化机制失衡引起的。肾脏是产生活性氧（ROS）的器官［15］。氧化应激在肾功能损害的病理生理学过程中起作用，并且是CKD 进展的介质［15］。CKD 进展的特点是细胞丢失、再生功能性薄壁组织的能力下降、呼吸功能障碍，肾脏纤维化、肾小管和肾小球细胞受损，导致ROS产生增加［15］。ROS在组织中的积累可能是导致细胞凋亡的原因，也可能是细胞凋亡的结果［16-17］。研究表明，对顺铂诱导的AKI 大鼠注射MSC-Exo 可减少ROS 产物（如8-羟基脱氧鸟苷），增加谷胱甘肽含量，减少肾实质细胞凋亡，还可以激活细胞外信号调节激酶（ERK），促进肾小管上皮细胞增殖［17］。MSC-Exo 的抗氧化活性可能涉及核因子E2 相关因子（Nrf2）表达上调［8］，后者是一种结合抗氧化反应元件的转录因子，可提高ROS 清除酶的表达，如超氧化物歧化酶和血红素加氧酶1［18］。研究表明，MSC-Exo 和微泡［19］分别通过下调NOX2 表达减轻单侧肾缺血和IRI 大鼠的氧化应激，可能是因为MSCExo 传递的miRNA 激活Nrf2 或抑制NOX2 表达。另一项IRI 相关研究发现，MSC-Exo 通过激活Keap1-Nrf2信号通路，刺激线粒体抗氧化防御和ATP生成，通过减少线粒体碎片，保护肾近端小管上皮细胞免受氧化损伤，使线粒体膜电位正常化，增加线粒体DNA 拷贝数。而且，有学者发现，miR-200a-3p 可被MSC-Exo转运至肾近端小管上皮细胞，靶向Keap1-Nrf2信号通路，进行修复肾近端小管上皮细胞线粒体的功能［20］。上述实验结果表明，MSC-Exo 中的miRNA可通过调节细胞内信号通路来减轻肾脏氧化应激，从而达到治疗肾脏疾病的效果。

3 抗纤维化

肾纤维化是许多进行性肾脏疾病的最终共同途径，其特征是细胞外基质（ECM）蛋白产生增加，基质降解减少，细胞—基质相互作用失调，炎细胞浸润和肾上皮细胞到间质细胞的转化。肾小管上皮细胞损伤至肾纤维化的发展高度依赖于成纤维细胞和肌成纤维细胞。受损的肾小管上皮细胞可以向成纤维细胞释放含转化生长因子（TGF-β）的外泌体，导致成纤维细胞活化、肌成纤维细胞转化和基质生成［21］。研究显示，在5/6 肾次全切除模型中，单次给予MSC-Exo 可以保护残肾功能，防止肾小管萎缩和间质淋巴细胞浸润，并限制肾纤维化［22］。肾纤维化相关研究发现，MSC-Exo 可以将miRNA-LET7C 递送至肾小管上皮细胞，诱导LET7C 表达增加，从而抑制胶原蛋白Ⅰα1、Ⅳα、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和TGF-β1的表达，缓解肾纤维化［23］。Hippo 信号是参与CKD 进展的关键途径，它可控制器官大小并调节组织再生［24-25］。在Hippo 途径中，叶酸相关蛋白（YAP）是一种重要的效应蛋白，在纤维化中起着不可或缺的作用［26］。JI 等［27］研究发现，人脐带血来源的MSC-Exo可以增加单侧输尿管梗阻大鼠模型肾脏组织中酪蛋白激酶1δ 和E3 泛素连接酶β-TRCP 的表达并促进YAP 泛素化和降解，从而抑制ECM 沉积，减轻肾脏纤维化。LIU 等［28］发现，人脐带血来源的MSC-Exo 通过干预ROS 介导的p38 MAPK/ERK信号通路从而减轻肾间质纤维化。同时，有证据表明，MSC-Exo 能将肾小管细胞阻滞在G2/M 期，下调胶原沉积相关蛋白的表达，减轻肾缺血所致的肾纤维化［29］。由此也揭示了MSC-Exo替代细胞疗法治疗肾纤维化疾病的可能性。MSC-Exo还通过抑制纤维化基因（α-SMA、TGF-β1、Ⅰ型胶原α1）的表达，减少肾小管细胞坏死、减轻肾间质纤维化［30］。有学者对高脂饮食和链脲佐菌素诱导的胰岛素缺陷型糖尿病小鼠注射MSC 和MSC-Exo，发现可抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）、TGF-β1的表达和肾小管间质纤维化，从而减轻糖尿病肾损伤［31］。由此说明，对于肾脏疾病，MSC-Exo 治疗可能是一种有效和安全的干预肾纤维化的方法。

4 抗炎症反应

炎症是造成肾损伤的主要原因。外泌体的抗炎作用主要通过调控其内的免疫调节分子或表面蛋白的表达，从而最大限度地减少免疫细胞（如巨噬细胞、T 细胞和NK 细胞）的浸润［32］。MSC-Exo 中的抗炎细胞因子包括IL-13、IL-18、神经纤维营养因子等。同时，有研究发现，MSC-Exo 中还含有IL-1b、IL-6、TNF-α、MCP-1 等促炎细胞因子［33］。还有证据表明，MSC-Exo 的miRNA 可介导受损组织的再生、纤维化活动和免疫炎症，如miR-let-7b 可抑制TLR4途径［34］，miR-21、miR-23a、miR-145 靶向下调TGFβ2，miR-let-7c 靶 向TGF-βR1 等［23］。SHEN 等［32］发现，MSC-Exo 可以减轻AKI 小鼠的炎症反应，降低血肌酐、尿素氮水平，并抑制C-C 基序趋化因子受体2的活性来促进肾损伤修复。在肾IRI 小鼠中，脂肪来源的MSC-Exo 可以通过下调炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1）的表达而促进肾功能恢复［35］。在败血症诱导的AKI 小鼠模型中，脂肪来源的MSC-Exo 干预可显著降低血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-6 和MCP-1的表达，抑制肾脏炎症［36］。有学者对IRI大鼠移植MSC 或MSC-Exo，发现TNF-α 和IL-1β 等炎症因子表达降低［37］。WANG 等［10］发现，MSC-Exo 能抑制肾小管上皮细胞中炎症因子的表达，并可通过抑制mTOR 磷酸化激活自噬，上调自噬标记蛋白LC3B和自噬相关基因（ATG5、ATG7）的表达。还有研究表明，脂肪来源的MSC-Exo 可上调Sox9 基因表达，修复IRI 小鼠肾小管上皮细胞并促进其增殖，纠正缺血缺氧，减少间质炎症细胞浸润，并抑制TGF-β1/Smad3 通路从而减轻肾纤维化，减缓AKI 向CKD 的转变［9］。此外，MSC-Exo 中的miRNA 可介导组织炎症反应。研究发现，脂肪来源的MSC-Exo 可通过miR-26a-5p抑制TLR4和NF-κB/VEGF 炎症途径，从而减轻糖尿病肾病损伤［38］。有证据表明，脂肪来源MSC-Exo 具有免疫抑制和抗炎潜力，其能调节巨噬细胞极化，将巨噬细胞从M1 表型转变至M2 表型［39］。有临床研究证实，MSC-Exo 能改善CKD 患者的肾功能指标、降低炎症因子水平，并且整个研究期间患者均未发生明显的不良反应［40］。然而，MSCExo 的抗炎和免疫调节具体机制尚不清楚，还需进一步研究明确。

总之，MSC-Exo 已经在肾脏疾病中显示出巨大的治疗潜力。MSC-Exo 能够抑制肾固有细胞凋亡，减轻肾损伤的严重程度。MSC-Exo 可减少ROS 产物，改善线粒体功能，调节细胞内信号通路来减轻肾脏氧化应激反应。在肾纤维化进程中，MSC-Exo 可抑制纤维化相关蛋白表达，减轻肾间质纤维化。MSC-Exo还可介导免疫炎症反应，减轻炎症浸润，发挥肾脏保护作用。虽然MSC-Exo在肾脏疾病治疗中取得一定的成果，但是MSC-Exo 的具体作用机制尚未阐明。随着研究不断深入，外泌体有望成为治疗肾脏疾病的新策略。