氢气在骨关节疾病中的研究进展

杨少强综述,包倪荣审校

0 引 言

氢气(hydrogen, H2)是一种无色、无味、无臭、具有还原性的小分子气体。长久以来，氢气被认为是生理惰性气体而未受到重视。2007年，Ohsava等[1]报道吸入2%氢气可选择性地清除羟自由基(·OH)及过氧亚硝基阴离子(ONOO-)并显著改善大鼠脑缺血再灌注损伤，该研究在医学界引发了广泛关注。在随后的研究中，氢气在多种疾病模型中被证明具有较好的治疗效果，其潜在的作用机制也得到广泛研究，虽然其分子机制尚不完全清楚，但目前研究多认为氢气可能通过抗氧化、抗炎、抑制凋亡及调控信号通路等途径发挥治疗作用[2-3]。本文就氢气可能的作用机制和其目前在骨关节疾病中的研究进展作一综述。

1 氢气发挥治疗作用的相关机制

1.1 氢气的抗氧化作用氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内细胞水平上氧化和抗氧化系统失衡，导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)绝对或相对增多而引起组织损伤。ROS是含氧自由基的总称，主要包括·OH、ONOO-、过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子、一氧化氮等，ROS参与体内多种细胞正常生理功能，在信号转导、基因调控和细胞循环中是重要的细胞信使，但过量的毒性较强的自由基如·OH、ONOO-可导致核酸断裂、蛋白质变性、生物膜的损伤及脂质过氧化，从而引起细胞凋亡和坏死[4]。ROS在骨科多种疾病的发生中扮演重要的角色，Tudorachi等[5]报道ROS可诱导软骨细胞和间充质干细胞的细胞外基质丢失、细胞老化、线粒体障碍及细胞凋亡，引起软骨下骨丢失，从而加速骨关节炎的发生。ROS也是调节破骨细胞分化和吸收的重要组成部分，对于研究骨吸收相关疾病如骨质疏松非常重要[6]。作为一种新兴的抗氧化气体，氢气的抗氧化作用在骨关节领域也得到一定研究。Cheng等[7]通过改良Hulth法建立大鼠膝关节炎(osteoarthritis,OA)模型，给予大鼠膝关节腔注射富氢水2周，结果发现与OA组相比，富氢水治疗明显降低软骨中COX-2、iNOS和NO等自由基表达，软骨HE染色结果显示，相较于OA组，富氢水组软骨明显增加，软骨退化明显减轻，表明氢气可通过其抗氧化作用减轻软骨损伤，延缓OA进展。有研究发现氢气(特别是50%和75%浓度)可阻止骨髓单核细胞向破骨细胞分化，并抑制破骨细胞功能及相关蛋白标记物的表达，这可能与氢气抑制细胞内ROS有关，预示氢气可能会成为一种新型抗骨吸收药物[8]。

1.2氢气的抗炎作用炎症反应参与多种疾病的病理过程，对机体损伤机制主要包括免疫系统的过度激活和炎性因子的释放，炎症与骨关节疾病的发生密不可分[9]。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)主要特征之一是由于免疫细胞持续涌入关节内而引起的滑膜炎，导致促炎因子的过度产生，其中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)被认为是RA滑膜细胞因子网络的中心枢纽，这些细胞因子刺激破骨细胞的形成和骨与软骨的降解，也能诱导其他促炎介质如IL-1和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的释放[10]。银屑病关节炎(psoriaticarthritis,PsA)也是一种免疫介导的炎症性疾病，以皮肤和关节受累为主。在银屑病患者中，滑膜内膜受累及的例高达30%，且银屑病患者以每年3%的速率进展为PsA，PsA可导致关节侵蚀和畸形，给患者和社会带来很大负担[11]。Ishibashi团队对24例RA患者进行了随机、双盲、安慰剂对照研究，患者连续静脉输注5天含氢等渗盐水，输液后即刻及4周后进行抽血检测，发现相较于对照组，氢气治疗组的血清IL-6、TNF-α及基质金属蛋白酶3(matrix metallopro-teinase-3,MMP-3)水平、尿8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-ODdG)均有明显下降，输液后及4周后28个关节疾病活动度(disease activity score in 28 joints,DAS28)评分也得到改善，表明氢气可通过其抗炎作用有效改善患者关节炎症状[12]。之后Ishibashi等[13]又使用三种氢气给药方法分别治疗3例PsA患者：静脉滴注含氢等渗盐水、吸入3% 氢气、饮用富氢水，结果发现治疗期间3例患者的DAS28评分及银屑病面积及严重指数评分均下降，在治疗结束时，银屑病皮肤病变几乎消失；其中病例1和病例2的IL-6水平在氢气治疗期间降低，病例1中浓度较高的IL-17x在氢气治疗后降低，病例1中TNF-α水平也有所下降，因此氢气治疗对银屑病及PsA有很大潜力。

1.3氢气的抗凋亡作用细胞凋亡途径主要有三条，一是外源性途径：通过胞外信号激活细胞膜上的死亡受体而发生凋亡；二是内源性途径：通过线粒体通路释放凋亡酶激活因子进而发生凋亡；三是颗粒酶介导的凋亡途径。其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)和B细胞淋巴瘤2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)是细胞凋亡途径中关键的凋亡因子。研究发现OA患者软骨组织软骨细胞凋亡率明显高于正常人软骨组织，提示软骨细胞凋亡在OA发病机制中起重要作用[14]。Lu等[15]使用75% 氢气处理过氧化氢叔丁基(tert-butyl hydroperoxide,TBHP)诱导的软骨细胞凋亡，发现氢气上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并有效降低了Bax、细胞色素c及Caspase-3等促凋亡因子的表达，经过TBHP刺激后，P-JNK在软骨细胞中表达增加，而氢气的处理显著抑制了P-JNK的表达。随后建立小鼠内侧半月板失稳OA模型,术后给予小鼠每日吸入75% 氢气，术后8周小鼠膝关节X线及软骨Safranin-O染色显示氢气治疗减少了表浅软骨的破坏和蛋白多糖的丢失，滑膜炎及软骨OARSI评分也与染色结果一致；TUNEL染色中OA组细胞凋亡比例明显高于Sham组，氢气治疗组则明显逆转了这种病理现象，免疫组化结果显示小鼠关节软骨中caspase-3及P-JNK的表达下降，表明氢气可能通过抑制JNK信号通路的激活来发挥抗凋亡作用，对OA具有潜在的保护作用。

1.4氢气对信号通路的调控作用有学者对321篇氢气相关的原创文章进行分析，观察到大部分文章都涉及到氢气的抗氧化、抗炎及抗凋亡效应，但是氢气对·OH、ONOO-的特异性清除作用并不能完全解释其抗炎及抗凋亡功能，这应该还与其调控细胞内信号通路有关[16]。在骨关节炎的发展进程以及软骨再生过程中,有许多生物信号通路参与其中，其中Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与OA的发生与加重密不可分，β-catenin是该通路的关键因子，其高表达可促使软骨细胞病理性成熟及加速凋亡[17-18]。Lin等[19]发现氢气通过增强降解复合物中β-catenin的磷酸化和降解，抑制了人骨关节炎软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，而在手术诱导的大鼠OA模型中，氢气通过减少β-catenin的积累并增加SOX-9表达来减缓软骨退化。骨重建需要成骨细胞和破骨细胞的稳定平衡，破骨细胞过度分化是骨质疏松、RA等病理性骨病形成的重要原因，Li等[20]的研究中，氢气通过抑制NF-κB受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear Factor-κ B Ligand, RANKL)诱导的细胞核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)及蛋白激酶B(Akt)信号通路，并可活化核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)，激活Nrf2-HO-1抗氧化信号通路，从而阻止RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞的分化。

2 氢气在骨关节疾病相关研究

2.1 RA氧化应激和炎症在RA中扮演着重要作用，ROS的过度产生和清除失衡，导致炎症发生、破骨细胞行为异常和软骨与骨的损伤[21]。Meng等[22]通过H2O2诱导人RA成纤维样滑膜细胞氧化损伤，观察到氢气的处理提高了细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表达、降低了8-ODdG水平，进一步实验发现这可能与氢气对MAPK、NF-κB活性的抑制有关；他们随后建立了小鼠关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型，造模成功后给予小鼠每日腹腔注射富氢等渗盐水，对照组腹腔注射PBS溶液，45d后病理结果显示对照组较实验组滑膜增生、关节狭窄、炎性细胞浸润和软骨破坏等症状更为明显，大体形态上实验组的小鼠肢体红肿程度也明显减轻。Xu等[23]开发了一种可生物降解自驱式镁-透明质酸生物微马达，由包含镁微粒的HA水凝胶内层及聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]外层组成，PLGA注入生物体内后会缓慢降解，镁微粒与体液不断反应持续生成氢气发挥治疗作用；该团队在超声引导下将微马达注入CIA大鼠膝关节腔，发现氢气显著降低大鼠体内TNF-α, IL-6, 和IL-1β等促炎因子的表达，病理及免疫组化结果也提示氢气减轻了关节滑膜炎症和软骨侵蚀。氢气也被日本学者用于临床治疗RA，Ishibashi团队给20名RA患者连续4周每天饮用530 mL富氢水，结果患者的尿8-ODdG水平和DAS28评分均下降，后又对24例RA患者连续4周输注5 d含氢等渗盐水，观察到相较于对照组，氢气组的血清IL-6及MMP-3水平、尿8-ODdG均有明显下降，说明氢气可以有效改善RA患者症状[12,24]。

2.2OAOA是一种以关节软骨退变和继发性骨质增生为主的慢性关节疾病，按照发病原因分为特发性和继发性(可继发于创伤、炎症、先天发育不良等)，目前已成为老年人活动障碍和社会负担的重要原因之一[25]。氧化应激与炎症互为因果循环，共同参与骨关节炎的病理生理过程中[26]。氢气因其选择性抗氧化和抗炎特性，对OA是否有治疗作用也引起学者们的关注。有学者建立家兔创伤性关节炎(TA)模型，给予实验组腹腔注射氢气饱和等渗盐水8 mL/kg，1次/3 d，对照组注射等量等渗盐水；6周后发现实验组家兔治疗后较治疗前膝关节肿胀明显减轻，而对照组治疗前后肿胀无缓解；实验组中血清及关节液NO明显下降，关节液中HA显著提升，而对照组治疗前后上述指标变化无统计学意义，表明氢气对治疗兔TA有一定疗效[27]。Lin等[19]给予OA大鼠自由饮用富氢水8周，Safranin-O染色发现相对于饮用脱氢水，饮用富氢水大鼠的膝关节软骨结构更为完整；细胞实验进一步表明饮用富氢水可以通过抑制软骨细胞Wnt/β-catenin信号转导减缓OA大鼠软骨退化。另外有研究提出一种新型氢气缓释系统，该系统由含Mg粉的左旋聚乳酸[poly (l-lactic acid),PLLA]微球构成，该研究将Mg/PLLA微球注射进OA小鼠膝关节附近肌肉内当作原位储存仓库，通过体液中Mg的钝化/活化持续释放高于治疗浓度的氢气，发现Mg/PLLA微球可以有效减轻小鼠膝关节炎炎症反应，并减轻膝关节软骨破坏[28]。

2.3骨质疏松症骨质疏松症是以骨量减少，骨质量受损及骨强度降低，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病。ROS过度累积会抑制成骨细胞活性，同时会加速破骨细胞分化促进骨吸收，从而导致骨小梁减少和骨质疏松[29]。Sun等[30]使用后肢悬吊法建立了大鼠骨质疏松模型，造模6周期间同时给予大鼠饮用富氢水治疗，结果显示饮用富氢水可有效减轻失重引起的股骨和腰椎骨密度的下降，细胞实验发现富氢培养基可抑制微重力诱导的ROS产生，促进成骨细胞分化并抑制破骨细胞分化，从而减轻微重力引起的骨丢失，这表明氢气可能对航天飞行员或卧床病人引起的骨丢失有预防意义。Wu等[31]通过体外实验发现氢气可显著抑制RANKL诱导的NF-κB通路的激活，从而限制破骨细胞分化。之后建立去卵巢小鼠骨质疏松模型，给予实验组小鼠每日吸入60%浓度氢气6 h，对照组饲养在正常空气条件下，6周后取材分析，观察到实验组小鼠的骨小梁数量和骨密度较对照组提高40%以上，血清中炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低50%以上，表明氢气具有治疗绝经后骨质疏松症的潜力。

2.4激素性股骨头坏死股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是一种呈进行性发展的髋关节退行性病变，以软骨下骨微骨折和随后的股骨头塌陷为特征，最终导致髋关节功能障碍，激素是非外伤性ONFH的主要原因，ROS参与ONFH的发病机制，不仅可通过调节RANKL信号通路促进破骨细胞形成和分化，还可导致血管及成骨细胞系损伤[32]。Huang等[33]用泼尼松龙建立家兔ONFH模型，实验组给予家兔腹腔注射富氢等渗盐水，1次/d，连续2周，安慰剂组相同条件下注射等渗盐水，结果观察到相对于安慰剂组，实验组家兔血浆中血管内皮生长因子、血栓调节蛋白和脂质过氧化物等血管内皮损伤及氧化应激标记物的水平明显降低，而GSH水平升高，病理染色及免疫组化也提示富氢水注射改善了家兔ONFH模型股骨头骨小梁结构，显著增加了骨组织微血管密度，初步证明氢气可以通过抑制氧化应激减轻激素性ONFH。Li等[34]在激素性骨坏死家兔造模同时腹腔注射氢气，10 mL/kg，连续7 d，模型组不进行干预；病理及免疫组化结果发现相对于模型组，氢气组骨坏死发生率明显降低，模型组的骨髓中8-OHdG阳性造血细胞簇明显少于模型组，血液检查也提示氢气处理后激素引起的GSH含量下降和丙二醛含量增加均明显减轻，氢气组股骨近端细胞凋亡率也明显低于模型组，提示氢气可通过抑制氧化损伤、血管损伤和细胞凋亡来预防激素性骨坏死。

2.5运动医学相关疾病自2010年起，许多研究人员对氢气在运动医学相关疾病的效应进行了评估。Meng等[35]通过手术建立了大鼠跟腱粘连修复模型，发现相较于等渗盐水组，腹腔注射富氢水组大鼠血浆中SOD、GSH增高，丙二醛水平下降，肌腱粘连度评分较高，肌腱HE、Masson染色也显示富氢水组组织炎性细胞浸润更少、胶原纤维排列更有序，表明氢气可以减少肌腱修复后粘连和炎症反应。Dejan等[36]对急性踝关节扭伤运动员受伤后24 h内每4 h行30 min富氢水踝关节水浴治疗，并与传统标准RICE方案(休息、冰敷、压迫、抬高)进行了比较，结果显示富氢水水浴方案可更明显减轻踝关节肿胀，单腿平衡时间更久。之后该团队又对1位患有Ⅱ级急性踝关节扭伤的专业运动员使用超饱和富氢水踝关节水浴治疗(方法同上)，24h后随访发现患者疼痛评分由受伤时50分(中度疼痛)降低到20分(轻度疼痛)，踝关节肿胀减轻了2.8%，背屈运动范围改善了27.9%，表明氢气在处理运动性软组织损伤也有一定作用[37]。

3 结语与展望

作为一种新兴的治疗性医用气体，氢气因其独特的生物学效应，在骨关节疾病应用中有多重优势：首先，氢气由于其本身极小的分子量和电中性、非极性的特性，可以轻易穿过细胞膜，进入线粒体、内质网和细胞核中发挥效应，而这些细胞器是产生ROS和DNA损伤的主要部位。其次，众多研究表明，氢气可通过选择性抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用对多种骨关节疾病发挥治疗效应；第三，目前并未发现氢气对细胞的副作用，氢气发挥效应的同时不会干扰细胞正常氧化还原反应和细胞内信号传导，正常治疗浓度下很少与其他气体反应，氢氦氧混合物长期应用于潜水作业中可证明其生物安全性。然而，氢气在研究应用中仍然面临一些问题。由于氢气溶解度很低，且释放速率较快，在局部应用时难以维持有效的治疗浓度，氢气治疗骨关节疾病的应用途径可能会因此受到限制。虽然目前研究都已证明氢气的生物学效应，但大多停留在效应研究，已研究的作用机制不足以阐明其效果，需要更多的基础研究去证实。目前氢气只被应用于少数骨关节疾病中，且大多集中于动物实验，其临床疗效并不确切。氢气探索道路上依旧困难重重，需要大量的基础和临床研究来推动其发展，但我们依旧相信氢气在骨关节疾病预防和治疗中有着巨大应用潜力。