MicroRNA 在肺腺癌表皮生长因子受体—酪氨酸激酶抑制剂耐药中的作用及其机制研究进展

程万里，刘鑫 ，任文俊，2，汪俊其 ，张立人，王平

1 昆明医科大学第二附属医院胸外科，昆明 650101；2 云南省第一人民医院心脏大血管外科

肺癌是世界上癌症相关死亡的主要疾病［1］。近年肺腺癌的发展日益严重，多数发现时已是中晚期［2］，失去手术根治机会。表皮生长因子受体（EGFR）是一种酪氨酸激酶受体，作为HER 家族受体中的一员，它是由具有酪氨酸激酶活性的C 端细胞内催化区域、N 端细胞外配体结合位点和疏水性跨膜结构域组成［3］。EGFR 激活突变在肺癌发生和细胞增殖过程中有非常重要的作用［4-5］，由于EGFR 突变的发生，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）成为晚期肺腺癌患者治疗主导药物［6］，EGFR-TKI 也被批准为 EGFR突变患者的一线治疗药物［7］，治疗效果虽好，但存在耐药性［8］。因此，有必要探寻提高药物敏感性的有效调节剂以及监测耐药发生的生物标志物。

微小RNA（miRNA）是一类由内源基因编码的短小非编码RNA 分子，大部分miRNA 长度为19～22 个核苷酸［9］。有研究［10-13］表明，miRNA 可作为促癌或抑癌基因，靶向作用于耐药、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡相关基因，调控多种因子的表达，参与肿瘤的发展和耐药。据报道，miRNA 对肺腺癌EGFR 信号通路以及相关细胞因子的正常表达有重要调节作用，特异性miRNA 的失调可能是癌细胞化疗耐药性产生的主要因素。上述这些研究均表明miRNA 参与肺腺癌耐药的发展过程，因而，明确miRNA 在肺腺癌EGFR-TKI 耐药中的具体作用，为探索EGFR-TKI 耐药的克服、药物敏感性的提升、耐药发生的监测以及新型药物开发提供了全新思路。肺腺癌EGFR-TKI 耐药机制主要有EGFR 表达异常、EGFR 基因突变、酪氨酸激酶受体扩增、上皮间质转化（EMT）等。近年，miRNA 在肺腺癌EGFRTKI 耐药的不同机制中作用的研究已取得一定成果，现作以下综述。

1 miRNA在EGFR表达异常致肺腺癌EGFR-TKI耐药中的作用及其机制

靶向化疗是晚期肺腺癌的关键治疗，EGFR 的异常表达则严重影响EGFR-TKI 药物的敏感性，成为肺腺癌患者预后的巨大障碍。有研究者用过表达miR-7 转染肺腺癌细胞，发现与未转染的癌细胞比较，高表达miR-7 的细胞存活率明显下降，再通过Western blotting 法检测发现EGFR 的表达受miR-7的负向调节，miR-7 下调导致EGFR-TKI 的敏感性降低从而产生耐药性［14］。miR-7 的负向调节在化疗耐药中起到了重要作用，通过检测miR-7 的表达可监测耐药的发生，及时调整患者治疗。有研究者发现，miR-608、miR-4513 以及 miR-1262 在 EGFR-TKI治疗肺腺癌细胞（PC9 和H1299）时发挥不同作用，miR-608 和miR-1262 的表达显著增强了EGFRTKI 在肺腺癌细胞中的抗增殖作用，而miR-4513的表达则明显提升癌细胞的耐药性，造成这种差异的主要因素是miRNA 等位基因单核苷酸多态性（SNP），miR-608 SNP rs4919510、miR-1262 SNP rs12740674 和 miR-4513 SNP rs2168518，通 过 介导miRNA 的表达，导致EGFR 通路相关因子表达失衡而出现上述情况15-16］。一项研究［17］表明，miRNA与肿瘤免疫微环境（TIME）也有着密切关系。利用病理学检查EGFR-TKI 耐药肺癌组织发现CD8 阳性T细胞浸润水平明显降低，体外实验显示miR-1的上调可抑制CD8阳性T细胞的迁移、浸润水平，改变了TIME 的特征，促进了肿瘤EGFR-TKI 耐药的发生和发展。表明miRNA 可通过调控TIME 特征进而影响化疗药物的敏感性，miRNA 抑制剂和TIME 特征预测可能为EGFR-TKI 耐药的克服和监测提供了新策略。ZHANG 等［18］在研究肺腺癌中 NOTCH 信号与EGFR-TKI 耐药关系时发现，NOTCH 成员中的NOTCH3 在肺腺癌EGFR-TKI 耐药细胞株（HCC827 GR6）中上调，NOTCH3 又可调控下游胶原蛋白1A1（COL1A1）的表达，二者同时促进肿瘤细胞的增殖。miR-150 已被证实为NOTCH3 的转录后调控因子，miR-150 直接靶向调控NOTCH3 的表达，通过 miR-150/NOTCH3/COL1A1 轴 参 与 EGFR-TKI 耐药。另外，在肺腺癌miR-630/YAP1/ERK 通路中，低表达的miR-630反馈性调节YAP1去靶向，并通过反馈通路中的ERK 因子使丝氨酸75 位点发生磷酸化，降低促凋亡蛋白Bad 的表达，导致EGFR-TKI 的抗肿瘤敏感性下降［19］。这些证据均表明miRNA 在EGFR异常致肺腺癌EGFR-TKI耐药中起重要作用。

2 miRNA在EGFR基因突变致肺腺癌EGFR-TKI耐药中的作用及其机制

据研究［20-21］报道，在接受EGFR-TKI 治疗的肺腺癌患者中超过半数会出现二次突变。在一、二代EGFR-TKI 药物治疗中多数患者会出现T790M 的突变，原因是EGFR 基因20 外显子第790 位点上的苏氨酸（T）突变为甲硫氨酸（M），增加了催化区域与三磷酸腺苷（ATP）的亲和力，因此ATP和EGFR-TKI之间形成竞争性结合关系，影响EGFR-TKI 的结合导致敏感性降低或消失。另外，第三代EGFR-TKI 药物是通过第797 位点上的半胱氨酸残基共价结合发挥抗肿瘤作用。由于二次突变，EGFR 797位半胱氨酸（C）被丝氨酸（S）取代，严重降低了EGFR-TKI 的结合率而出现耐药。因此，肺腺癌患者在使用第三代药物治疗时所面临的主要阻碍是EGFR C797S 突变［22-23］。一项研究［24］发现，具有 EGFR T790M 突变的两组小鼠肺癌细胞：Ⅰ组EGFR-TKI 敏感两株细胞（PC-9 和H3255），Ⅱ组EGFR-TKI 不敏感两株细胞（（RPC-9 和H1975），用阳离子脂质体使 miR-7 的质粒表达后发现两组癌细胞生长均被显著抑制。此外，miR-7 的 3'- UTR 还可与 EGFR 的 mRNA 结合，降低EGFR 表达，对癌细胞的抑制作用进一步加强。说明miR-7对T790M 突变的耐药有着显著的克服作用。就EGFR T790M 突变的肺腺癌患者而言，开发miR-7相关药物可能使其治疗更具针对性。有研究［25］发现，miR-138-5p 在 EGFR-TKI 耐药细胞株表达明显下调，进一步在EGFR T790M 突变的肺腺癌细胞株中转染过表达miR-138-5p，可恢复EGFR-TKI的治疗敏感性，说明高表达水平的miR-138-5p 可能是克服EGFR T790M 突变致肺腺癌细胞株对EGFRTKI耐药的关键因素。

3 miRNA 在酪氨酸激酶受体扩增致肺腺癌EG⁃FR-TKI耐药中的作用及其机制

近年，在应用EGFR-TKI 治疗的患者中，酪氨酸激酶受体基因扩增所导致的二次耐药也扮演着重要角色。酪氨酸激酶受体是一种跨膜蛋白，具有自主磷酸化活性，胞外区与肝细胞生长因子（HGF）配体结合发生受体二聚化，诱导ErbB3 磷酸化、PI3K/Akt通路激活，使下游通路持续活化导致EGFR-TKI 的抑制作用失效。HGF 不仅促进酪氨酸激酶受体扩增，还可与其结合调节下游SAE2 和circRNA CCDC66 的表达，诱导肺腺癌耐药［26-27］。另外有研究［28］发现，酪氨酸激酶受体扩增的同时部分EGFR T790M 也处于突变状态，二者之间存在“合作关系”共同发挥耐药作用。有研究者在治疗酪氨酸激酶受体-TKI耐药的过程中发现，miR-205/ERRFI1（ERRB受体反馈抑制因子1）轴是酪氨酸激酶受体-TKI 耐药的新型中介。酪氨酸激酶受体-TKI 耐药的维持需要EGFR 的活化。miR-205 可下调ERRFI1 的表达，下调的ERRFI1 又进一步导致EGFR 通路的活化，出现酪氨酸激酶受体-TKI 耐药表型［29］。说明miR-205 对耐药的发生起到了重要推动作用。有研究［30］表明，在 HGF 诱导的 EGFR-TKI 耐药细胞系HCC827 和 PC-9 中，利用 miR-34a 联合 EGFR-TKI 共同作用时，发现酪氨酸激酶受体靶点可被抑制，对HGF 介导的耐药有抑制作用，并诱导肿瘤细胞凋亡。这表明miR-34a 在酪氨酸激酶受体突变中具有重要作用，miR-34a 联合化疗药物可增加化疗药物的敏感性，提升肺腺癌患者的治疗效果。

4 miRNA 在 EMT 致肺腺癌 EGFR-TKI 耐药中的作用及其机制

EMT 表型改变是肺腺癌患者EGFR-TKI 耐药的另一种重要表现。EMT 是肿瘤上皮组织向纺锤状间叶组织转化［31］，表现为上皮细胞的黏附性消退，间质成分表达增加。EMT 在肺腺癌耐药中的机制虽未完全明确，但在EMT 过程中可通过检测其相关蛋白增加或减少来提示肿瘤EMT 发生。研究［32］表明，在肺腺癌EMT 发生过程中EGFR-TKI耐药患者组织中EMT 相关蛋白表达会有所变化，上皮细胞消退时连接蛋白表达量下调如E-钙黏合蛋白，而间质蛋白表达增加如间质波形蛋白，这些蛋白的表达变化可能为肿瘤 EMT 发生提供线索。LI 等［33］研究发现，致癌基因miR-181b-5p 可靶向作用于E-钙黏合蛋白使其表达下调，促进肿瘤的侵袭和转移。同时，miR-181b-5p 通过上述靶向作用还可介导EMT 的发生。有研究者发现，一种神经内分泌因子VGF 在肺腺癌细胞亚群中高表达，VGF 表达使EGFR-TKI 的敏感性下降而引起耐药，当沉默VGF 时EGFR-TKI 的敏感性又重新恢复，VGF 还可诱导EMT，从而增加肺腺癌细胞的迁移和侵袭行为［34］。另外，有研究者发现，3%～10%的EGFR 突变肺腺癌患者在接受EGFR-TKI 治疗后会转化为小细胞肺癌（SCLC），肺腺癌转化为SCLC 的机制未完全阐明，但已证实RB1、TP53以及PIK3CA 突变占主导作用［35］。有研究者研究miR-92a 时发现，miR-92a 具有促进癌细胞增殖、侵袭和转移功能，此功能是耐药发生的主要因素。miR-92a 通过抑制同源性磷酸酶-张力蛋白（PTEN）的表达，使 PTEN 失去作为 PI3K/AKT 通路负调控因子作用，激活PI3K/AKT，诱导EMT 发生，引起肺腺癌细胞EGFR-TKI 耐药［36］。这些研究均说明miRNA 的调控在EMT 致肺腺癌EGFR-TKI 耐药中的重要作用，这也为提高肺腺癌患者的疗效和耐药监测提供了新的可能性。

5 miRNA 在其他原因致肺腺癌EGFR-TKI 耐药中的作用及其机制

PTEN 为一抑癌基因的蛋白质产物，可抑制下游PI3K/AKT 通路激活，促进肿瘤细胞凋亡。当PTEN 发生甲基化、等位基因缺失等突变时，下游PI3K/AKT 通路磷酸化水平升高，则失去抑癌作用，导致肺腺癌 EGFR-TKI 发生耐药［37］。研究显示，癌基因miR-21 表达量越高，EGFR-TKI 耐药现象越明显，二者之间呈正相关。进一步研究［38］表明，过表达的miR-21 可靶向抑制PTEN 的表达，导致下游PI3K/AKT 信号通路激活，诱导肺腺癌EGFR-TKI 耐药的发生。另一项研究［39］发现，miR-214在EGFR-TKI耐药细胞系（HCC827/GR）中显著上调，通过双荧光素酶报告系统验证了PTEN 是miR-214的直接靶点，高表达的miR-214 直接靶向作用PTEN，使PTEN/PI3K/AKT信号通路失调而介导EGFR-TKI耐药。这些证据表明miRNA 的表达水平可影响PTEN 的抑癌作用，导致相关下游通路激活而发生耐药。或许开发有效的miR-21和miR-214抑制剂药物，将大幅度提升PTEN突变肺癌患者EGFR-TKI的疗效。

胰岛素样生长因子1 受体（IGF-1R）激活突变后，可通过激活PI3K/AKT 信号通路介导肺腺癌肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡以及增强肿瘤细胞的抗药 性［40］。MA 等［41］将 miR-497mimic 转 染 至 EGFRTKI 耐药的人肺腺癌细胞系（A549/GR）中，发现IGF-1R 和磷酸化AKT1表达水平降低，EGFR-TKI的抗癌效果显著提高。说明高表达的miR-497 可抑制IGF-1R 蛋白的表达，阻断通路下游的AKT1 激活。提示通过提高miR-497 的表达水平可逆转肺腺癌IGRF-1R 突变患者的耐药以及提升EGFR-TKI 敏感性。另一项研究［42］表明，miR-200b可抑制IGF-1R的表达，降低PI3K/AKT 和MAPK 信号通路的活性，增强EGFR-TKI 的抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡作用。可见，在其他原因导致的EGFR-TKI 耐药中，miRNA 的表达也发挥出至关重要的调控作用，也为提高EGFR-TKI治疗疗效提供了思路。

综上所述，miRNA 可调控多种肺腺癌EGFR -TKI 耐药途径。miRNA 在肺腺癌EGFR-TKI 耐药机制中通过自身的表达水平，打破EGFR-TKI 耐药机制平衡，因此了解其在获得性耐药中潜在的分子机制，是提升EGFR-TKI 疗效的关键。 miRNA 本身可成为药物开发的靶点，通过miRNA 干扰方法调节体内miRNA 的表达量可对EGFR-TKI耐药关键因子如EGFR、酪氨酸激酶受体、HGF、EMT、PTEN、IGF-1 等以及信号转导通路进行调控，达到逆转肿瘤细胞EGFR-TKI 抗药性目的；另外，通过检测目标miRNA在体内的表达变化，使监测肺腺癌EGFR-TKI 耐药发生成为可能。目前miRNA 在肺腺癌EGFR-TKI耐药中的研究仍处于起步阶段，miRNA 在肺腺癌耐药中的具体机制还未完全阐明，依然面临着诸多挑战。作为化疗药物有效的调节剂和监测耐药发生的生物标志物，miRNA 的可行性、安全性、有效性以及低成本高效益还均需大量的研究去验证。