高糖环境培养、lncRNA 58992 过表达SV40 中lncRNA 58992和纤维化标志物表达观察

丁明璐，王小花，刘海峰

牡丹江市牡丹江医学院，黑龙江牡丹江157000

糖尿病肾病（DN）是糖尿病患者常见的微血管并发症之一，也是发展为终末期肾病的主要原因，其病理特征表现为肾小球肥大、系膜增生、肾小球基底膜增厚和细胞外基质（ECM）沉积［1-6］。随着生物医学的发展，越来越多的研究表明DN 发展的过程涉及多种机制，主要包括炎症反应、氧化应激、山梨醇醛糖还原酶活性的激活、晚期糖基化终产物含量的上调、细胞内蛋白激酶C 活性的升高和细胞周期蛋白依赖性激酶表达的增加［7］。近年研究［8］发现，长链非编码RNAs（lncRNAs）在糖尿病肾纤维化中的具有重要作用，并受到广泛关注。

lncRNAs 是长度大于200 个核苷酸的非编码RNAs。研究表明，lncRNAs 在剂量补偿效应、表观遗传、细胞周期和细胞分化调控等众多生命活动中发挥着重要作用，目前已成为遗传学的研究热点。最近有研究［9］表明，降低lncRNA ANRIL 可通过调控Wnt/β-连环蛋白和MEK/ERK 信号通路来抑制糖尿病肾小球系膜细胞模型的增殖和纤维化；lncRNA ISG-20通过影响miRNA-486-5p/NFAT5诱导AKT的磷酸化来促进糖尿病肾纤维化［10］；此外，p53 可通过抑制 lncRNA ZEB1-AS1 来抑制 DN 的发生发展［11］，以上研究结果表明，lncRNAs 在糖尿病肾纤维化的发生发展中具有重要的调控作用。

前期生物信息学的研究显示，糖尿病肾纤维化小鼠肾脏组织中lncRNA 58992 表达明显上调，但其尚未在基础及临床研究中进行验证。2020 年10 月—2021年12月，本研究在高糖环境下培养肾小球系膜细胞系SV40 建立糖尿病肾纤维化模型，观察了lncRNA 58992 在高糖诱导的肾小球系膜细胞系SV40中的表达水平，并观察了过表达lncRNA 58992的肾小球系膜细胞系SV40 中纤维化细胞因子α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤维连接蛋白（FN）和I 型胶原（Col I）的表达变化，以明确lncRNA 58992 对肾小球系膜细胞系SV40纤维化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、试剂与仪器 肾小球系膜细胞系SV40 由牡丹江医学院生命科学学院保存，DME/F12 培养基购自HyClone公司，DMEM 低糖培养基购自Gibco 公司，胎牛血清（FBS）购自于碧云天生物有限公司，过表达lncRNA 58992 的质粒pcDNA 3.1-lncRNA 58992 和qRT-PCR 中所用引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成，质粒抽提试剂盒和总RNA 提取试剂盒购自OMEGA，SYBR Green Master试剂购自罗氏上海有限公司，Col I、α-SMA 和 FN 抗体购自Abcam 公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 购自北京中山金桥生物有限公司，Cy3 标记的羊抗 兔 IgG、Hoechst 33342、细 胞 裂 解 液 和 lipofectamine 8000 转染试剂购自碧云天生物公司，ECL化学发光试剂购自Biosharp 公司，磷酸酶抑制剂购自哈尔滨新海基有限公司，蛋白marker 购自Thermo Scientific 公司，其余试剂均为国产或进口分析纯。主要仪器：荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems）、离心机（Thermo Scientific 公司）、恒温培养摇床（上海一恒科技仪器有限公司）、超微量核酸蛋白测定仪（北方北京仪涛商贸有限公司）、电泳仪（BIO-RAD）、超灵敏多功能成像仪（Eppendorf 公司）和CO2培养箱（Thermo Scientific公司）。

1.2 肾小球系膜细胞系SV40 的培养及lncRNA 58992 质粒的转染 小鼠肾小球系膜细胞系SV40采用含10% FBS 和1% 青霉素/链霉素的DME/F12培养基，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。选取对数生长期状态良好的细胞，接种到6孔板中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h，用含有0.5%FBS 培养基饥饿 12 h，将细胞分成 3 组：NG + 58992组、HG 组和 NG 组，其中 NG+58992 组转染过表达lncRNA 58992 质粒24 h，继续低糖（5 mmol/L）培养24 h；HG 组低糖环境培养24 h 后再经高糖（25 mmol/L）环境培养24 h；NG 组为低糖培养48 h，收集各组细胞，进行纤维化相关基因和蛋白的检测。

1.3 各组 lncRNA 58992、FN、Col I mRNAs 的检测 采用qRT-PCR 法。取各组细胞，消化并收集细胞，经总RNA 提取试剂盒提取各组细胞的RNA，超微量核酸测定仪检测总RNA浓度。取RNA 1 μg，按照逆转录试剂盒步骤逆转录合成cDNA。qRT-PCR检测纤维化相关基因。引物序列如下：ColIF：5’-GAGCGGAGAGTACTGGATCG-3’，R：5’-GCTTCTTT TCCTTGGGGTTC-3’；FNF：5’-AATGGAAAAGGGGA ATGGAC-3’，R：5’-CTCGGTTGTCCTTCTTGCTC-3’；GAPDH F：5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’，R：5’-ACACATTGG GGGTAGGAACA-3’。RT-qPCR 反应体系：cDNA 2 μL，正向和反向引物各 0.8 μL、SYBR Green Mix 9 μL、无菌三蒸水7.4 μL。反应程序：50 ℃升温2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s；60 ℃退火 1 min；扩增 40 个循环，以 GAPDH 为内参，以2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

1.4 各组α-SMA、FN 和Col I 蛋白的检测 ①采用免疫荧光法。取对数生长期肾小球系膜细胞系SV40，4%多聚甲醛室温固定20 min，0.1%Trition X-100 通透 15 min，5% BSA 室温封闭 1 h，一抗4 ℃孵育过夜，室温避光孵育Cy3 标记的山羊抗兔二抗1 h，Hoechst 33342 染核 20 min，激光共聚焦显微镜拍取图片，并观察各组中红色荧光表达强弱。②采用Western blotting 法。取各组细胞，消化并收集细胞，离心吸掉上清，细胞裂解液与磷酸酶抑制剂按照100：1 比例重悬细胞，在4 ℃冰箱摇床孵育30 min，4 ℃，1 2 000 r/min 离心 10 min，取上清，Nano Drop 2000 测浓度，用上样缓冲液稀释蛋白，100 ℃沸水中煮 10 min，立即放在冰上，取 40 μg 蛋白上样，进行SDS-PAGE 电泳，电泳结束后，电转移至PVDF 膜上，室温于5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h。分别置于FN（1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）和 β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃冰箱孵育过夜，放置辣根过氧化酶标记的二抗（1∶20 000）孵育液中，室温孵育1 h。加ECL 化学发光试剂，避光显影，超灵敏多功能成像仪曝光拍照。用Image J软件进行灰度值分析。

1.5 统计学方法 采用Graphpad 8.0 软件进行统计分析。服从正态分布的计量资料以 xˉ±s 表示，比较采用单因素方差分析，两两比较采用Student-t 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组 lncRNA 58992、FN、Col I mRNAs 的比较 HG 组、NG 组中lncRNA 58992的相对表达量分别为1.45 ± 0.22、1.00 ± 0.03，两组比较，t=3.867，P＜0.05。NG+58992 组、HG 组、NG 组 FN mRNA 相对表达量分别为8.78 ± 1.86、13.17 ± 1.95、1.00 ±0.01，三组比较，F=47.26，P＜0.01；NG+58992 组与NG 组相比，t=8.504、P＜0.05；HG 组与NG 组相比，t=10.80、P＜0.01；NG + 58992 组与 HG 组相比，t=3.49、P＜0.05。NG + 58992 组、HG 组、NG 组 Col I mRNA 相对表达量分别为 2.40 ± 0.41、4.16 ±0.83、1.00 ± 0.06，三组比较，F=26.37，P＜0.01；NG+58992 组与NG 组相比，t=6.818，P＜0.05；HG 组与NG 组相比，t=6.472、P＜0.01；NG + 58992 组与 HG组相比，t=3.517、P＜0.05。

2.2 各组Col I、α-SMA 和FN 蛋白的比较 细胞免疫荧光检测结果表明，NG 组中 Col I、α-SMA 和 FN蛋白均有少量的红色荧光，表明该蛋白在细胞中存在本底表达，而 HG 组和 NG + 58992 组中 Col I、α-SMA 和FN 的红色荧光均增强，说明lncRNA 58992可诱导纤维化相关的蛋白表达上调。

Western blotting 检测结果显示，NG+58992 组、HG 组、NG 组FN蛋白相对表达量分别为0.75±0.24、0.91±0.17、0.27±0.13，三组比较，F=9.81，P＜0.05；NG+58992组与NG 组相比，t=3.376，P＜0.05；HG 组与 NG 组相比，t=9.53，P＜0.05；NG + 58992 组与 HG组相比，t=1.924、P＞0.05。NG+58992组、HG 组、NG组α-SMA蛋白相对表达量分别为0.28±0.03、0.59±0.06、0.14 ± 0.03，三组比较，F=89.37，P＜0.05；NG+58992 组与 NG 组相比，t=3.799、P＜0.05；HG 组与NG 组相比，t=9.438、P＜0.001；NG + 58992 组与HG组相比，t=22.19、P＜0.01。

3 讨论

DN是最主要的糖尿病微血管并发症之一，是慢性肾病和终末期肾脏病的重要原因。慢性肾病的最终病理结果是肾间质纤维化，其组织病理学特征包括ECM 过度产生、沉积、炎症细胞的浸润、肾小管细胞的损失、肌纤维的聚集和肾小管周围微血管的变薄。研究表明，当正常肾组织被纤维化组织替代时，肾脏结构显著改变并导致肾功能受损。另外，患有慢性肾病的患者发展到肾间质纤维化阶段，患者的肾功能会逐渐降低，最终需要透析或肾移植来维持其功能。因此，充分了解糖尿病肾纤维化的作用和机制，寻找糖尿病肾纤维化的标志物及治疗策略具有理论价值和现实意义。

近年，lncRNAs 在糖尿病肾纤维化中的作用和机制引起越来越多的关注。LncRNA MALAT1 通过降低miR-2355-3p/IL6ST 轴缓解糖尿病肾纤维化；另外，敲除lncRNA H19 通过促进miR-29 诱导的内皮—间质转化促进糖尿病肾纤维化；LncRNA NEAT1通过吸附miR-23c加速DN的发生和发展［12］。因此，lncRNAs 与糖尿病肾纤维化密切相关。lncRNA 58992 是最近新发现的lncRNAs 分子，但其在糖尿病肾纤维化中的作用尚未进行研究。

肾小球系膜细胞是多种细胞因子的分泌源，同时又是多种细胞因子作用的主要靶细胞，系膜细胞作为肾脏的固有细胞，具有分泌ECM、产生细胞因子、吞噬和清除大分子物质以及平滑肌细胞收缩的功能，在DN的发生发展中起着重要作用。为了进一步研究lncRNAs与糖尿病肾纤维化之间的关系，前期生物信息学发现，在糖尿病肾纤维化模型小鼠肾脏中异常表达lncRNA 58992。本研究发现lncRNA 58992在糖尿病肾纤维化模型细胞中表达显著增加，同时过表达lncRNA 58992可促进正常肾小球系膜细胞系SV40中Col I、α-SMA 和FN 等mRNAs和蛋白的表达增加，提示lncRNA 58992 可影响肾小球系膜细胞系SV40纤维化，可能参与DN的肾脏纤维化进程。总之，本研究首次在高糖诱导的肾小球系膜细胞系SV40 中发现lncRNA 58992 高表达，同时lncRNA 58992 可以调控肾小球系膜细胞系SV40 中纤维化的发生参与DN 的病理过程。接下来，我们将进一步研究lncRNA 58992 促进糖尿病肾纤维化发生的作用机制，为糖尿病肾纤维化的治疗与预防提供理论基础。