烟草NtNRAMP3b的克隆及功能分析

尹卓然 轩栋栋 李晨依 李长 柴哲，2 王锟瑶 赵孟琦 彭靖媛 董杰 贾宏昉

（1.河南农业大学烟草学院，郑州 450002；2.陕西中烟工业有限责任公司，西安 710000）

铁是植物生长发育所必需的一种微量元素，可以通过活化叶绿素合成相关酶、呼吸作用相关酶进而影响植物光合作用、呼吸等生理活动，最终影响植物的生长发育［1］。烟草是一种重要的叶用模式植物和经济作物。烟草缺铁时会出现叶片黄化［2］，影响烟叶的产量和品质［3-4］。研究烟草对铁的吸收与转运可以有针对性的阻止缺铁环境对烟草生长发育的危害，提高烟叶的产量和品质。

研究表明，广泛存在于植物中的NRAMP 家族主要参与植物对铁（Fe）、锰（Mn）和镉（Cd）等金属离子的吸收和转运［5］。拟南芥（Arabidopsis thaliala）中已有6 个NRAMP 家族基因的功能被证实［6-10］，其中AtNRAMP1参与Mn 和Fe 的吸收转运［11］，AtNRAMP3和AtNRAMP4参与Mn 和Fe 的再利用［12］，且编码蛋白位于液泡膜上。水稻（Oryza sativa）中有7 种NRAMP 家族基因已被报道［13-17］，其中OsNRAMP1负责转运Cd 和Fe［18］，OsNRAMP2参与Fe 从液泡到细胞质的转运［19］，杨猛［20］研究表明OsNRAMP3 主要参与Mn 的再利用，OsNRAMP5是Fe、Mn 和Cd 的转运蛋白，OsNRAMP6 为Cd 转运蛋白。

关于烟草NRAMP 家族成员的功能鲜见报道，陈邦兰等［21］推测有10 个成员属于NRAMP 家族，其中Tang 等［22］研究表明NtNRAMP5编码的蛋白定位于质膜，有转运Mn 和Cd 的能力。Jia 等［23］研究证实NtNRAMP3编码的蛋白定位于液泡膜，有转运Cd 的能力，但关于NRAMP 基因家族成员在烟草中对Fe 的功能尚未明晰。

本研究从烟草中克隆获得一个NRAMP 家族基因，通过鉴定该基因与其他物种基因的同源性，命名为NtNRAMP3b，进一步通过RT-qPCR 和转基因技术系统探究了NtNRAMP3b在铁转运中的功能，为明晰NtNRAMP3b在烟草转运铁中的机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

普通烟草品种K326（Nicotiana tabacumcv，K326）作为供试材料，将烟草种子置于黑暗培养室（温度28℃）中生长，培养3 d，然后将发芽的幼苗置于光照培养箱（光16 h 28℃/暗8 h 22℃，光强为300 μmol/（m2·s），相对湿度60%）中。采用霍格兰营养液水培法，营养液pH 调至7.0［24］。在种子露白后使用1/4 正常营养液培养3 d，之后更换为1/2正常营养液培养3 d，最后更换为正常营养液培养4 d。培养结束后对K326 进行正常处理（CK：霍格兰营养液）和缺铁处理（-Fe：0 μmol/L FeSO4·7H2O与Na2-EDTA 螯合物），处理7 d 后取样将收集的植物用去离子水洗涤，样品的根、茎、幼叶和老叶（幼叶为完全展开的叶片从上往下数第2 片，老叶为完全展开的叶片从上往下数第7 片）用于测定基因的瞬时表达分析。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 参考烟草在GenBank 收录的烟草NtNRAMP3b基因组数据库（GenBank 登录号：XM_016614857.1）中已发表的序列数据，利用烟草K326 的基因特异性引物（F：5′-ATGCCTCCACACGATGACGA-3′；R：5′-TCAATTCTCTATGCTGGTGA-3′），以烟草cDNA 为模板进行PCR 扩增，扩增条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃2 min，35 个循环；72℃ 5 min。送Invitrogen 生物公司测序验证，获得全长cDNA 序列信息。

1.2.2 序列分析方法 利用NCBI 软件的Open Reading Frame Viewer（ORF）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）进行基因序列的蛋白翻译，利用Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）和PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html）分析NtNRAMP3b 的蛋白结构，利用在线网站NetPhos-3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）预测NtNRAMP3b 的磷酸化位点，利用TMHMM-2.0（https://services.hea lthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）预测NtNRAMP3b 蛋白的跨膜结构域，运用DNAMAN 进行蛋白质多序列比对、分析同源性，利用MEGA6.0 制作邻接树（neighbor-joining tree，NJ），分析NtNRAMP3b与NRAMP 家族成员的亲缘关系，在线网站MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）分析序列基序（motif），利用TBtools［25］将NJ-tree 和motif 组合，对NtNRAMP3b 与烟草、拟南芥中已经研究的NRAMP 家族进行序列分析。

1.2.3 启动子分析 以烟草NtNRAMP3b全长序列为探针，利用Sol Genomics Network 网站进行BLAST搜索基因全长，在ATG 上游取一段长2 000 bp 的启动子序列，利用PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线工具分析启动子序列的顺式元件。

1.2.4 基因表达分析 运用Primer Premier6.0 软件设计NtNRAMP3b基因扩增引物序列（F：5′-GATGACGAACAGCAACAAT-3′；R：5′-AATGACAACACCAGACCAA-3′），按照Invitrogen 公司的RealMaster-Mix（SYBR Green）试剂盒说明书进行RT-qPCR，试验数据以烟草组成型表达基因NtL25（GenBank：L18908.1，引物序列为F：5′-CCGTCCAAAAAATCTGACCC-3′；R：5′-TCTTCAAAGTCTTAGGTCGG-3′）为内参基因，3 次重复试验，采用2-ΔΔCT算法进行分析，ΔΔCT=Treat（样品-L25）-CK（样品-L25）［26］。

1.2.5 载体的构建及遗传转化 对测序正确的NtNRAMP3bcDNA 进行PCR 扩增得到基因全长序列，并设计引物（NtNRAMP3b-OE）与pCAMBIA1305 载体连接，该载体由花椰菜花叶病毒（CaMV）35S 启动子和胭脂碱合成酶终止子驱动，转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，经过菌液 PCR 检测对比后，得到过表达载体 pCAMBIA1305-NtNRAMP3b。利用电转化将其转入农杆菌 EHA105 感受态细胞中，筛选阳性菌液侵染野生型烟草K326［27］，室内繁种，收取转基因植株T0种子，繁种获得T2纯合植株用于接下来的研究。

1.2.6 转基因烟草株系对铁的耐受性鉴定

1.2.6.1 观察烟草表型并记录生物量 将WT 和NtNRAMP3b-OE株系OE1、OE2 用上述水培法培养约35 d，用缺铁营养液（-Fe：0 μmol/L）胁迫处理7 d，各材料取3 株长势一致的幼苗，测定生物量。

1.2.6.2 叶绿素浓度和铁浓度的测定 取正常处理和缺铁处理7 d 的WT 和NtNRAMP3b-OE幼苗，利用无水乙醇提取法测定叶片中叶绿素浓度，利用邻菲啰啉比色法测量各处理中不同材料的Fe 浓度。

1.2.6.3 相关基因瞬时表达的测定 铁还原酶基因（ferric reduction oxidase，FRO）与铁调节蛋白（iron-regulated transporter，IRT）已证实参与亚铁离子的吸收［28］，以NtL25为内参基因，利用RT-qPCR测定铁胁迫处理后NtIRT1（AB263746.F：5′-TGGCTATTGACTCCATGGCT-3′；R：5′-AGTAGTTTCGCGCCATCAAC-3′）和NtFRO2（XM_016644133.F：5′-TATTGGGCTGCCACTCATCA-3′；R：5′-CCAGCATAAGAGACGCCAAC-3′）的相对表达量。

1.2.7 数据分析 使用DPS 7.5 进行单因素完全随机试验统计分析，运用LSD 法进行多重比较，分析1%极显著水平并使用字母标记表示结果，利用Origin2018 和TBtools 作基因相对表达图。

2 结果

2.1 目的基因克隆及序列分析

克隆获得NtNRAMP3b，全长为1 530 bp，可编码509 个氨基酸。编码蛋白的分子式为C2621H4078N634O698S16，原子总数为8 047，相对分子质量为56.15 kD，理论等电点（pI）为5.77。带负电荷的残基的总数为42 个，带正电荷的残基有35 个，不稳定性指数为32.06，属于稳定蛋白。

2.2 蛋白结构分析

NtNRAMP3b 的二级结构中，α 螺旋占比51.47%，β- 转角占比9.04%，无规卷曲占比19.84%，延伸链占比19.65%；含有24 个丝氨酸、10 个苏氨酸和3 个酪氨酸，推测在这些位点可能发生磷酸化。NtNRAMP3b 具有11 个疏水的跨膜区域（图1）。

图1 NtNRAMP3b 跨膜结构域分析Fig.1 Cross-membrane domain analysis of NtNRAMP3b

2.3 同源性与系统进化树分析

NCBI 中查询烟草、拟南芥与水稻的NRAMP 家族基因的蛋白质序列，运用DNAMAN 进行蛋白质多序列比对。结果（图2）表明，NtNRAMP3b 与NtNRAMP2 的同源性为67.28%，与AtNRAMP3 的同源性为74.85%，与水稻OsNRAMP6 的同源性为61.86%，推测NtNRAMP3b 与AtNRAMP3 具有相似的功能。

图2 同源性分析Fig.2 Homology analysis

运用MEGA6.0 制作邻接树，分析NtNRAMP3b与其余家族成员的亲缘关系，并验证NtNRAMP3b的潜在功能。在线网站MEME 分析序列基序（motif，图3），NtNRAMP3b 与拟南芥AtNRAMP3、AtNRAMP4 的亲缘关系较近，同时，NtNRAMP3b 与拟南芥AtNRAMP3 含有相似的motif 类型，表明他们可能具有相似的生物学功能。

图3 系统进化树和motif 分析Fig.3 Phylogenetic tree and motif analysis

2.4 启动子分析

如图4所示，启动子中除含有所必须的TATABOX 和CAAT-BOX 外，还含有植物激素响应元件（如1 个赤霉素反应元件（P-box），2 个脱落酸反应性涉及的顺式元件（ABRE）和1 个与水杨酸反应顺式作用元件（TCA-element））、组织特异性调控元件（如2 个与分生组织表达相关的顺式作用元件（CAT-box））和防御与胁迫响应元件（如2 个低温响应顺式元件（LTR）和5 个厌氧诱导响应元件（ARE））。其中，植物激素响应元件（如ABRE）可以促进或抑制植物激素（如脱落酸）诱导基因的表达，从而表现出加速或减缓植株衰老过程；防御与胁迫响应元件（如LTR）在胁迫（如低温）下诱导基因表达，从而表现出相关基因的瞬时表达增强。

图4 启动子顺式元件分析Fig.4 Promoter cis-element analysis

2.5 基因表达模式分析

通过对NtNRAMP3b进行组织特异性表达分析，结果（图5）显示，NtNRAMP3b在叶片中表达量极高，其中，老叶是根部的8.07 倍，幼叶是根部的2.28 倍。通过对烟草植株进行缺铁处理后发现，NtNRAMP3b在各部位的相对表达量增加，其中，老叶是正常处理的3.39 倍。因此，该基因主要在叶片中表达，尤其是老叶，且受Fe 诱导表达。

图5 NtNRAMP3b 相对表达量Fig.5 NtNRAMP3b relative expression

2.6 缺铁处理对NtNRAMP3b-OE烟草的影响

测定OE1 与OE2 植株NtNRAMP3b的瞬时表达，结果（图6-A）显示，OE1 中相对表达水平高。观察烟株长势，测量生物量。结果（图6-B）显示，正常处理下（CK）生长的烟株生物量不存在差异。在缺铁处理后，烟株的整体生物量降低，相较之下，NtNRAMP3b-OE较WT 长势较好，且OE1 的生物量显著高于WT。叶绿素浓度结果（图6-C）显示，NtNRAMP3b-OE在缺铁处理下叶绿素浓度极显著的高于WT，表明NtNRAMP3b-OE烟株在缺铁环境中促进叶绿素合成，从而影响烟株光合作用，提高了烟株的生物量积累。

图6 不同铁浓度处理下的生物量Fig.6 Biomass under treatment with different cadmium concentrations

铁浓度测定结果（图6-D）显示，正常处理下，NtNRAMP3b-OE植株铁含量显著高于WT，可能参与烟草对铁的吸收。在缺铁条件下，NtNRAMP3b-OE叶片中的铁浓度低于WT，且OE1 与WT 间存在显著差异，说明缺铁处理后，NtNRAMP3b-OE植株的Fe2+被转运至液泡外，从而提高叶绿素合成途径相关酶活性和光敏素的合成，增加了叶绿素浓度和铁的再利用，通过影响光合作用来影响烟株的生长发育，从而使烟株生物量和叶绿素浓度增加、铁含量降低。

缺铁条件下，OE 株系中的NtIRT1与NtFRO2的相对表达量极显著高于WT（图7），说明NtNRAMP3b-OE植株在缺铁条件下通过增强NtIRT1与NtFRO2的表达，促进烟株对铁的吸收与利用。

图7 缺铁条件下基因的瞬时表达Fig.7 Transient expressions of genes under iron deficiency

3 讨论

本研究克隆获得NtNRAMP3b，全长1 530 bp，编码509 个氨基酸。其编码蛋白等电点为5.77，含有51.47%的α 螺旋（alpha helix），不稳定性指数为32.06，属于稳定蛋白，该基因编码蛋白的理化性质与余沁等［29］研究结果一致。不同物种中的NRAMP 含有10-12 个跨膜螺旋结构［30］，且高度保守。NtNRAMP3b 具有11 个疏水的跨膜区域，符合NRAMP 家族的跨膜结构特点。

Qin 等［31］研究表明NRAMP 可分为2 个亚家族，编码蛋白分别定位于细胞膜和液泡膜，2 个亚家族成员的功能差异较大［32］，其中，AtNRAMP2、AtNRAMP3、AtNRAMP4和AtNRAMP5定位于液泡膜上［8］，主要参与液泡中金属的释放过程。NtNRAMP3b 的同源性与系统进化树结果显示，NtNRAMP3b 与At-NRAMP3 的亲缘关系更近，Jia 等［23］研究表明NtNRAMP3 定位于液泡膜，属于膜转运蛋白，参与物质的转运过程。NtNRAMP3b在缺铁条件下上调表达，在叶片中的瞬时表达极显著高于正常处理。在缺铁处理下对铁浓度分析发现，NtNRAMP3b-OE叶片的铁含量低于WT，证实该基因在烟草中主要负责叶片中铁从液泡向外的转运过程。

Ihnatowicz 等［33］研究表明，NRAMP 家族在环境应激反应和光合作用等方面有调控作用［34］。启动子中的ABRE 可以促进或抑制植物激素（如脱落酸）诱导基因的表达，从而表现出加速或减缓植株衰老过程。低温响应顺式元件（LTR）在低温条件下诱导相关基因瞬时表达，从而改变植物的抗寒能力。低温对类囊体产生氧化损伤［35-36］，从而降低了光系统II（PSII）的功能。因此，可以通过RT-qPCR 进一步研究NtNRAMP3b在低温下的表达情况，验证NtNRAMP3b在逆境下的调控机制。

NRAMP 家族对Fe、Cd 和Mn 的转运与吸收可以影响植物的生长发育，主要表现在缺Mn 诱导PSII 光抑制，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），植物膜脂过氧化程度高；过量镉进入植物体内后影响植株生长发育，并通过食物链最终进入人体，危害人体健康［37-38］；缺铁（Fe）影响光系统I（PSI），导致叶绿素合成减少［39］。测定缺铁环境下生长的WT 和NtNRAMP3b-OE的铁浓度和叶绿素浓度发现，NtNRAMP3b-OE植株的叶绿素浓度显著高于WT，而Fe 含量低于WT，说明NtNRAMP3b参与烟草叶片中Fe 的转运，该基因过表达后，大量Fe 转运至液泡外，参与PSI，使叶绿素含量增加，降低了烟株中的铁含量。后期可通过不同Cd、Mn 条件处理烟株，观察不同处理下烟株表型与长势，测定叶绿素含量、Cd 浓度及ROS 含量来验证NtNRAMP3b对光合作用的调控机理和对Cd、Mn 的转运与吸收的分子机制。

4 结论

在烟草中克隆了天然抗性相关巨噬蛋白基因NtNRAMP3b，NtNRAMP3b主要在叶片中表达且受铁胁迫诱导并增强表达。初步验证了NtNRAMP3b主要参与铁元素的转运，影响叶片中铁的吸收与再利用。