新型冠状病毒核蛋白N端结构域的表达纯化以及晶体优化

2023-01-05陈铎刘永哲

生物技术通报 2022年12期

陈铎刘永哲

（1.首都医科大学附属北京朝阳医院呼吸与危重症医学科，北京 100020；2.首都医科大学附属北京朝阳医院感染和临床微生物科，北京 100020）

自2019年12月新型冠状病毒（SARS-CoV-2）爆发以来，对全球的经济社会造成了重大的影响，根据美国霍普金斯大学的统计，截至目前已经超过4.7 亿人次感染新型冠状病毒，超过600 万人死于新冠肺炎感染［1-2］。面对日益增长的新型冠状病毒感染病例，高效的检测手段和有效的抗体治疗是应对新型冠状病毒的重中之重。

SARS-CoV-2 是目前发现的基因组较大的正链RNA 病毒，基因组大小约为30 kb，其5′端的基因主要编码冠状病毒的16 个非结构蛋白［3-5］。基因组3′端编码冠状病毒的4 种结构蛋白，包括核蛋白（nucleocapsid，N）、表面刺突蛋白（spike，S）、小包膜蛋白（envelope，E）和外膜蛋白（membrane，M）［6-8］。N 蛋白是冠状病毒中含量最高的结构蛋白，位于病毒内部，具有较高的保守性。冠状病毒N 蛋白包含了N 端结构域和C 端结构域，是一种具有较高免疫原性的磷酸化蛋白，在病毒内部与病毒RNA结合形成螺旋衣壳，稳定病毒的基因组［9-13］。因此，N 蛋白是重要的冠状病毒检测靶点，同时也是关键的抗体开发靶点蛋白。

虽然新型冠状病毒的N 蛋白非常重要，但由于其蛋白中间存在柔性部分，全长蛋白并不稳定［14-15］。为了便于N 蛋白的结构生物研究和后续的抗体开发，本研究分析了N 蛋白全长的氨基酸序列，选取N 蛋白序列中的N 端结构域，约12 kD 的核酸结合序列作为靶蛋白，构建原核的表达质粒，在大肠杆菌中诱导表达新型冠状病毒N 蛋白N 端结构域重组蛋白，N2+亲和层析和分子筛凝胶层析探索N蛋白N 端结构域的纯化方式从而获得较高纯度的目的蛋白，通过Hampton 晶体试剂盒优化得到质量较高的N 蛋白N 端结构域蛋白质晶体，为后续N 蛋白N 端结构域的结构生物学研究和抗体制备提供关键研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pET28b 原核表达质粒由本实验室保存；N-N 蛋白（N 蛋白N 端结构域（47N-175G））基因由北京睿博生物科技有限公司进行优化合成；大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）和质粒扩增菌株DH5α 购自北京全式金生物技术有限公司；卡那霉素、DTT 和IPTG诱导剂购自大连美仑生物技术有限公司；酵母粉和蛋白胨购自OXOID 公司；盐酸、氯化钠和咪唑购自北京化工厂；HEPES 和六水氯化镁购自Amresco公司；DNA 胶回收试剂盒和小提质粒试剂盒购自杭州博日科技有限公司；SDS-PAGE 预制胶和Ni-NTA beads 购自南京金斯瑞生物科技有限公司；T4 连接酶和PCR mix 酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；限制性内切酶购自Thermo Fisher 公司；晶体筛选试剂盒购自Hampton 公司；16 孔晶体板购自天宇有机玻璃制品高分子有限公司；考马斯亮蓝R250 和G250 购自北京溪洋汇智科技有限公司；10 kD 超滤浓缩管（15 mL 和5 mL）购自Merck Millipore 公司；Superdex 75 10/30 GL 购自GE 公司。

1.2 方法

1.2.1 N-N 蛋白的序列合成和表达载体构建通过NCBI 数据库查询新型冠状病毒N 蛋白全长氨基酸序列（GenBank：MN908947.3），本实验使用CLUSTALW 网站进行氨基酸序列对比，选取N-N 蛋白（47N-175G）129 个氨基酸相对应的基因序列为目的序列，经北京睿博生物科技有限公司进行原核系统密码子优化并人工合成，N-N 蛋白的基因序列连入通用载体Topo。我们以Topo-N-N 为模板，N-N-F和N-N-R 为引物（表1），扩增新型冠状病毒N 蛋白N 端结构域基因序列。扩增目的基因片段通过DNA胶回收试剂盒进行片段回收，之后和质粒pET28b分别通过双酶切（NdeI 和XhoI）、T4 连接酶进行片段载体连接和转化进入DH5α 感受态进行质粒扩增，培养皿挑选阳性单克隆并通过小提质粒试剂盒进行质粒提取，双酶切和测序鉴定正确的重组目的质粒命名为pET28b-N-N。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 N-N 蛋白诱导表达将构建好的pET28b-N-N质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞中。通过卡那霉素抗性平板筛选阳性的表达菌株，转移至包含5 mL LB 培养基的小试管中并添加50 μg/mL 卡那霉素进行37℃ 220 r/min 过夜摇晃培养。第2 天将菌株转入包含1 L LB 培养基的大瓶中并添加50 μg/mL 卡那霉素进行220 r/min 摇晃培养至菌液OD600nm为0.8 时，降低培养温度至16℃，加入终浓度为0.4 mmol/L IPTG 进行过夜诱导，之后将菌液进行4 000 r/min 离心收集大肠杆菌，然后用lysis buffer（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2）重悬并进行高压均质破碎，12 000 r/min 离心后收集上清液进行后续的纯化。

1.2.3 N-N 蛋白表达和纯化大量诱导表达N-N 蛋白，诱导结束后离心、收集大肠杆菌，重悬高压均质破碎，高速离心获得含有大量目的蛋白的上清液，然后进行Ni2+亲和层析纯化，上样流速为1 mL/min，上样后用wash buffer（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2，20 mmol/L 咪唑）进行洗杂至G250 检测不变蓝，最后用Elution buffer（20 mmol/L HEPES，pH 7.0，150 mmol/L NaCl，4 mmol/L MgCl2，200 mmol/L 咪唑）洗脱目的蛋白并收集流出液。我们将流出液经过超滤浓缩管（截留蛋白分子量：10 kD）浓缩至1 mL，以1 mL/min 的流速上样，进行分子筛凝胶色谱层析（Superdex 75），收集最要的蛋白质峰，即为新型冠状病毒N-N 蛋白。通过SDS-PAGE 电泳对其进行纯度检测。

1.2.4 N-N 蛋白与RNA 相互作用的EMSA 分析通过EMSA 试验验证N-N 蛋白与核酸的相互作用。采用体积分数为10%的Native 蛋白胶，合成序列为UCUUAGGAGAAUGAC 的RNA，按N-N 蛋白和RNA 摩尔比为1∶1.2 的比例预混蛋白和核酸，加上等比例的甘油，冰上孵育2 h 后上样，冰浴电泳（7 mA，120 min）。结束后将蛋白胶放置到含有核酸染料的染液中染色10 min，在照胶仪上观察条带。

1.2.5 N-N 蛋白晶体优化将分子筛纯化的N-N 蛋白峰进行合并，经过超滤浓缩管（截留蛋白分子量：10 kD）浓缩至7 mg/mL 左右进行悬滴晶体生长条件筛选。晶体生长温度为16℃，试剂条件包括Hampton 公司的index1-96、PEGRx 1、PEGRx 2、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等试剂盒。最终在PEG/Ion Screen的23 号条件（0.2 mol/L Ammonium formate，20%W/V Polyethlene glycol 3350）初筛获得N-N 蛋白质晶体，以此条件为基础，进行晶体生长条件优化。优化手段包括以PEG/Ion Screen 的23 号条件为基础，按4∶1 的体积比分别加入index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等其他晶体筛选试剂，获得较大晶体后再进行Additive Screen 和Detergent Screen 最终优化。

2 结果

2.1 N-N蛋白的序列选取

使用CLUSTALW 网站对SARS-CoV-2（QHD 43423.2）、SARS-CoV（NP_828858.1）和MERS-CoV（YP_009047211.1）进行N 蛋白氨基酸序列对比，可以看出在N 蛋白的N 端结构域3 种病毒的差异较大，特别是MERS-CoV 与其他两种病毒的差异更大（图1），因此本研究选取了新型冠状病毒N-N 蛋白（47N-175G）129 个氨基酸序列作为目的蛋白序列，并在NCBI 查找对应的基因序列，通过生物公司进行基因合成构建原核表达重组载体，通过原核表达纯化获得性质较好特异性较高的N-N 蛋白。

图1 SARS-CoV-2、SARS-CoV 和MERS-CoV 的N 蛋白氨基酸序列对比Fig.1 Comparison of N protein amino acid sequences of SARS-CoV-2，SARS-CoV and MERS-CoV

2.2 N-N蛋白表达质粒的构建和鉴定

以Topo-N-N 为模板，生物公司合成N-N-F 和N-N-R 进行扩增，获得大小约350 bp 的目的基因片段，与预期的大小相符（图2），通过NdeI 和XhoI双酶切目的片段和载体，T4 连接酶22℃连接2 h 转化到DH5α 感受态中，通过带卡那霉素抗性的板子筛选获得阳性克隆，再通过双酶切鉴定和基因测序鉴定，获得pET28b-N-N 重组原核表达质粒。

图2 N-N 蛋白基因片段扩增结果Fig.2 PCR amplification result of N-N protein

2.3 N-N蛋白的纯化

将pET28b-N-N 质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，按照1.2.2 中的方法培养诱导N-N 蛋白的大量表达，采用Ni2+亲和层析柱和分子筛凝胶色75 谱层析柱纯化N-N 蛋白。N-N 蛋白在Superdex 75 分子筛中的出峰位置为16.5 mL，符合Superdex 75 分子筛的出峰情况，其峰尖280 nm 的吸收值约为260 nm 的2 倍为正常的蛋白质比值（图3-A），通过12% SDS-PAGE 蛋白质胶分析N-N 的纯化情况，经过Ni2+亲和层析柱和分子筛凝胶色谱层析柱的纯化，通过Quantity One 软件对蛋白胶进行积分定量分析，N-N 蛋白的纯度达到90%以上（图3-B）。

图3 N-N 蛋白的表达纯化Fig.3 Expression and purification of N-N protein

2.4 EMSA试验验证N-N蛋白与RNA相互作用

通过EMSA 试验证明了N-N 蛋白与RNA 确实具有较强的相互作用（图4），随着N-N 蛋白浓度的提高，可以形成稳定分N-N 蛋白-RNA 复合物。进一步明确N-N 蛋白结合RNA 的能力，从侧面验证N蛋白N 端结构域结合病毒基因组，稳定病毒基因组的功能。但是EMSA 无法准确定量N-N 蛋白与RNA的结合比例以及N-N 蛋白与RNA 结合的具体方式，这些将在后续实验中通过完整的N-N 蛋白-RNA 复合物结构来进一步验证。

图4 N-N 蛋白与RNA 结合的EMSA 结果Fig.4 EMSA result of binding of N-N protein and RNA

2.5 N-N蛋白的晶体筛选

将分子筛纯化的N-N 蛋白浓缩至7 mg/mL，加入2 mmol/L 的DTT 还原剂后进行晶体生长筛选。在PEG/Ion Screen 的23 号（0.2 mol/L Ammonium formate，20% Polyethlene glycol 3350 W/V）池液生长条件获得初筛N-N 蛋白晶体（图5-A）。以PEG/Ion Screen 的23 号条件为基础，按照4∶1 的体积比分别加入index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等其他晶体筛选试剂，在添加Crystal Screen 的45 号（0.2 mol/L Zinc acetate dihvdrate，0.1 mol/L Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5，18% Polyethlene glycol 8000 W/V）获得较大的晶体（图5-B）。之后再进行Additive Screen 和Detergent Screen 优化，最终在添加Additive Screen 25 号（1.0 mol/L Sodium malonate pH 7.0）下获得质量较高的N-N 蛋白晶体（图5-C）。

图5 N 蛋白的晶体优化Fig.5 Optimization of N protein crystal

3 讨论

冠状病毒包含4 种结构蛋白，N 蛋白是冠状病毒最重要的结构蛋白之一［16］，负责稳定病毒的基因组，协助病毒的转录复制过程。此外，N 蛋白具有较强的免疫原性［17］，可以诱导人体产生较强的免疫应答［18］。N 蛋白的抗体较S 蛋白的抗体更早出现［19］，而且检测率更高，维持时间更长，说明对于N 蛋白抗体检测试剂盒的开发比S 蛋白更加有优势［20-21］。由于N 蛋白全长序列中间存在柔性较大的部分，直接表达存在一定的困难［22］，为了获得大量稳定的N蛋白，本研究通过构建N 蛋白N 端结构域的原核表达系统，获得了大量的可溶N-N 蛋白，为后续抗体检测试剂盒开发［23］和抗体药物［24］开发提供重要的研究基础。

本研究参考Chatzileontiadou 等［25］的蛋白纯化方法，在获得大量的可溶N-N 蛋白基础上，通过Hampton 晶体试剂盒进行晶体筛选。但与既往的研究不同，根据初筛条件还需要进一步摸索条件，如上述结果中所述，既往大部分研究将分子筛纯化的N-N 蛋白浓缩至7 mg/mL，加入2 mmol/L 的DTT 还原剂，本研究为进行多轮晶体优化，最终获得质量较高的N-N 蛋白晶体，故以PEG/Ion Screen的23 号条件为基础，按照4∶1 的体积比分别加入index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2、PEG/Ion Screen 和PEG/Ion 2 Screen 等其他晶体筛选试剂，在添加Crystal Screen 的45 号获得较大的晶体，从而通过X 射线衍射试验，获得较好的衍射图像。此步骤获得的蛋白晶体，为N 蛋白N 端结构域三维结构的解析提供直接的研究基础。为后续的N 蛋白结构生物学研究，以及N 蛋白稳定核酸机制的解释提供了重要高纯度蛋白。

本研究还通过EMSA 试验定性验证了N-N 蛋白与RNA 具有明确的相互作用。随着N-N 蛋白浓度的提高，可以形成稳定分N-N 蛋白-RNA 复合物，该结果也被其他类似研究证实［26-29］。从侧面证实了N蛋白N 端结构域在稳定病毒基因组中的作用，为后续的N 蛋白功能研究提供思路和依据。

N 蛋白主要两大作用，一是结合在病毒的RNA，稳定病毒的基因组，二是可以结合转录复制形成N 蛋白的RNAP 复合物，促进基因组转录复制［30］。N 蛋白属于结构蛋白，目前开发的抗体试剂盒也是针对N 蛋白或者S 蛋白［26-27］。本研究通过N-N蛋白的表达纯化，主要是优化了后续的晶体生长条件，获得质量较高的N-N 蛋白晶体，后续将以此为基础解析N-N 蛋白晶体结构，为N 蛋白的结构生物学研究提供重要研究基础。同时，N 蛋白具有较好的机体免疫原性，本研究提供了N 蛋白N 端结构域原核表达纯化的方法，将为后续的抗体检测试剂盒开发，以及靶点N 蛋白的抗体药物研究提供关键的技术支撑。