冷沉淀质量抽检：凝血因子Ⅷ活性测定的影响因素

房云海（Fang Yunhai），张心声（Zhang Xinsheng）

（山东省血液中心山东省血友病诊疗中心，济南，250014；

冷沉淀在1964 年由美国医生Judith Graham Pool 首先发现，是采用特定的方法将新鲜冰冻血浆在1～6 ℃融化后，分离出大部分的血浆，并将剩余的冷不溶解物质速冻的成分血［1］。 冷沉淀的质量抽检需要进行凝血因子Ⅷ（FⅧ）活性测定，但对于如何测定冷沉淀中FⅧ的活性，尚无统一的标准。血站技术操作规程（2019 版）和全血及成分血质量监测指南（WS／T550-2017）要求在使用血凝仪测定时，应参照厂家使用说明［2-3］。 血凝仪厂家的使用说明往往是针对患者血浆FⅧ活性测定，而不是针对冷沉淀，冷沉淀中的FⅧ活性远高于日常检测的患者血浆，也远超标准曲线的检测范围，在测定过程中很多细节会影响测定结果。 我们根据日常工作经验和复习文献，对冷沉淀FⅧ活性测定全过程中需要注意的问题总结如下。

1 冷沉淀抽样的控制

目前血站技术操作规程（2019 版）要求成分血质量检查的抽样量为每月制备量的1%或至少4袋。 若该成分血每月制备量少于4 袋的，由血站根据统计过程抽样原则自行制定抽样频次［2］。 由于不同血型的献血者本身FⅧ的水平也有差异，冷沉淀的凝血因子质控抽样时要注意血型的影响，如果抽检4 袋冷沉淀的话，建议每个血型一袋，如果抽检袋数超过4 袋，建议按照制备量选择血型抽检。 O型血的人FⅧ和血管性血友病因子（VWF）整体偏低，所以O 型血浆和冷沉淀的FⅧ和VWF 含量也整体偏低。

1979 年7 月柳叶刀杂志发表的文章研究了冷沉淀中FⅧ含量和血型的关系［4］，这些冷沉淀均来源于一个单位全血（约513 mL）分离后的血浆（约225 mL），其中O 型冷沉淀FⅧ含量要低于其他血型，而Rh 阴性或阳性则对凝血因子水平影响不大（表1）。 我们在2012 年检测了40 袋冷沉淀中FⅧ含量，这些冷沉淀均来源于400 mL 的全血，其中O型冷沉淀中FⅧ含量最低，AB 型冷沉淀中FⅧ含量最高（表2）［5］，跟柳叶刀杂志的结果相符。 不符合要求的11 袋冷沉淀中，有7 袋是O 型的冷沉淀，而这些O 型冷沉淀本身的原料血浆中FⅧ就整体偏低。 目前尚不能常规开展制备前的凝血因子检测，所以我们在临床使用O 型冷沉淀治疗时，应该适当调整用量。

表2 我中心检测40 袋冷沉淀原料血浆及冷沉淀中FⅧ含量

2 冷沉淀融化条件的控制

冷沉淀应该在37 ℃水浴中快速充分融化，一般需要融化15～20 min。 室温融化或融化时间太短会形成冷沉淀，影响FⅧ的检测；融化时间太长，会增加FⅧ的损耗。

血站技术操作规程（2019 版）里面冷沉淀的制备方法有两种，分别是离心法和虹吸法，最后的体积都是40 ～50 mL。 冷沉淀的体积增加以后，充分融化需要的时间也随之增加。

英国最新的出凝血实验室检测指南指出，如果血浆不能及时检测，冻存后融化的要求是在37 ℃融化5 分钟或直至充分融化，目的是避免形成冷沉淀，影响检测结果［6］。 融化5 min 的检测用血样一般只有1 mL 左右，冷沉淀体积是40～50 mL，如果融化5 min，显然不能充分融化。 英国的一项针对冷沉淀质控的研究中把冷沉淀在35±2 ℃融化20 min，冷沉淀的FⅧ含量是符合要求的，所以冷沉淀融化时间不超过20 min，对于FⅧ的含量影响不大［7］。

3 冷沉淀融化后取样和样品检测前的保存条件

冷沉淀融化后，取样检测前需要充分混匀，混匀后的样本更能代表整个冷沉淀的质量。 混匀时应避免剧烈振荡和产生气泡。 冷沉淀融化后放在室温，尽快上机检测，最长不要超过4 个小时。 2021 年发布的凝血因子活性测定技术标准中，要求在4 h 内完成血浆标本检测［8］。 再有要避免检测血样的反复冻融，血样一旦融化后，除非检测都完成，不要再次冻存。

冷沉淀融化后储存的温度条件，不同的文献上有三种选择，分别是放到冰水混合物上、2 ～4 ℃冷藏和室温保存。 放置到冰水混合物上，只是在室温高于25 ℃时需要这样操作，目前大部分的实验室都不会超温，所以一般不推荐这个选择。 而且冰水混合物温度太低，可能激活凝血因子Ⅶ，影响最终检测结果。

2016 年，英国的研究人员把冷沉淀融化后，在室温（22 ～24 ℃）放置，然后在融化后0、4、10、24、48、72 h 的时间点检测。 与融化后0 h 相比，从24 h开始，FⅧ降低有统计学意义，但降低的不到10%。在0 到48 h，有94%的冷沉淀检测FⅧ水平符合英国标准的要求，在72 h 的点，88%的冷沉淀检测FⅧ水平合格，都高于英国标准要求的75%以上的抽检样本合格。 该项研究显示，在室温条件下FⅧ的活性比我们预期的要更稳定［7］。

4 冷沉淀FⅧ活性测定样品的预稀释

质量合格的冷沉淀中F Ⅷ活性一般在200 ～1000 IU／dL，远超过标准曲线的上限，为保证检测的结果在标准曲线的范围内，在检测FⅧ的时候必须进行预稀释，一般稀释5 倍或者10 倍。 具体稀释倍数应该根据实验室实际情况进行验证。 世界血友病联盟实验手册中稀释液包括凝血因子检测中的缓冲液或乏凝血因子Ⅷ，但首选的是乏凝血因子Ⅷ［9］。我们实验室冷沉淀一般稀释5 倍后进行检测，稀释液采用全自动血凝仪配套的缓冲液。

5 FⅧ活性测定结果的表达方式

在进行FⅧ活性检测时，常用的单位有三个，分别是%，IU／dL（单位／分升）和IU／mL（单位／毫升）。

我们假定一个标准的正常人，他的凝血因子水平也是最标准的，就是1 mL 血浆里面有1 个单位的凝血因子，他的凝血因子水平就是1 IU／mL，也就是100%。

换算成IU／dL 单位，对于他来说每分升血浆是100 mL，每毫升里面1 个单位的凝血因子，每分升里面是100 个单位的凝血因子，所以他的凝血因子水平是100 IU／dL。 这个人的凝血因子水平用不同的单位表示为：100%＝100 IU／dL＝1 IU／mL。

血友病诊断与治疗中国专家共识中凝血因子检测的单位用的是IU／dL［10］，而我们国内检测报告上最常用的还是%这个单位。 但在冷沉淀质控中，计算结果时需要把凝血因子的单位换算到IU／mL。

6 冷沉淀FⅧ含量的计算

冷沉淀质控的要求是每袋冷沉淀的FⅧ含量，需要用冷沉淀的FⅧ活性水平乘上体积。 不同的全自动血凝仪，检测结果的单位可能有差别，但是最后计算FⅧ含量的时候，需要把凝血因子的单位换算到IU／mL，然后乘上冷沉淀的毫升数，就得到了每袋冷沉淀含FⅧ的单位数。 《全血和成分血质量要求》中冷沉淀质量控制项目要求来源于400 mL 全血的冷沉淀中FⅧ≥80 IU，来源于300 mL 全血的FⅧ≥60 IU，来源于200 mL 全血的FⅧ≥40 IU。

7 冷沉淀FⅧ含量质量抽检结果的解释和利用

由于献血者本身FⅧ含量的差异，75%以上的冷沉淀抽检合格即为符合血液质量要求。 如果抽检4 袋冷沉淀，低于75%的冷沉淀符合质量要求，可以考虑增加抽样数量，增加抽样数量后仍然不合格，那就要针对冷沉淀制备的整个过程查找原因，加强冷沉淀制备全过程的质量控制和标准化操作。

8 FⅧ活性测定试验标准曲线的绘制、使用与更新

标准曲线不是一成不变的，在试剂批号更换的时候需要重新定标，更新标准曲线；质控结果不理想的时候，也要考虑更新标准曲线。 通常使用商品化的标准血浆建立标准曲线，其标示值需溯源至国际标准物质，不推荐自制定标血浆。

一期法是目前最常见的凝血因子活性测定方法，采用一期法检测FⅧ，至少应进行2 个稀释度的检测，有条件可以进行3 个或3 个以上稀释度的检测，然后判读结果［11］。 检测结果与稀释度的线性关系与标准曲线进行比较，可以提示是否存在抗凝物或样本活化，同时也可以提高结果的可靠性。 应保证检测的结果在标准曲线的范围内，检测结果高于标准曲线的上限时，直接检测得到的结果就不可靠，需要选用稀释后检测的结果。

9 全自动血凝仪操作的质量控制

实验室应按照仪器试剂生产厂商的操作说明制定符合自己实验室要求的凝血因子检测标准操作程序文件，并严格按照标准操作程序文件的要求进行操作。 全自动血凝仪需要定期保养和校准，排除如光源不稳定、温度波动等机器故障影响。 全自动血凝仪宜选择使用配套试剂开展检测。 如使用非配套试剂，应进行性能验证。 试剂应按照贮存条件妥善保存并在有效期内使用。

10 FⅧ活性测定试验的室内质控

实验室应保证每次开机检测凝血因子时都进行一次正常水平和异常水平的室内质控。 目前我们实验室使用正常水平和异常水平两种商业质控品进行室内质控，还用冰冻血浆自制质控血浆同步检测，以保证检测结果的准确可靠。

商业质控品血浆在复溶后允许冻融一次，可以在复溶后分装冻存，在-70 ℃条件下最多可保存6个月。

当质控结果在允许范围之外时，需要明确失控的具体原因，并采取恰当的纠正措施。 只有质控结果在允许范围内时，才可以发放检测报告。

11 FⅧ活性测定的室间质评和比对

实验室应参加室间质量评价机构组织开展的室间质量评价活动，以保证采用相同实验室检测系统之间结果的可比性。 我中心出凝血实验室对外检测全部凝血因子及VWF 抗原和活性，实验室从2006年开始参加英国谢菲尔德的国际出凝血室间质评，目前还参加国家卫生健康委临床检验中心的凝血因子室间质评项目。

2014 年，国家卫生健康委临床检验中心针对72家开展凝血因子检测的临床实验室进行调查，仅有44 家开展室内质控，占61%，仅有17 家参加室间质评［12］。 国家卫生健康委临床检验中心目前已经开展了凝血因子室间质评项目，针对所有开展凝血因子检测的实验室，有条件的血站也可以报名参加。

12 人员培训

凝血因子检测需要有经验的实验室技术人员，才能保证检测结果的准确可靠。 世界血友病联盟发布的血友病管理指南，其中实验室检测部分指出，准确的凝血因子检测，需要经过培训的专业技术人员；进行检测的技术人员需要了解凝血因子检测的原理，并且在条件许可的情况下到专业的检测中心进行培训［13］。

13 结 语

质量抽检是确保冷沉淀质量合格，临床使用有效的重要保障，只有保证检测过程合理、检测结果可靠，才是有效的质量抽检。 我们的认识也有不足的地方，检测中的注意事项随着仪器和方法的更新，也会有改变，只有持续不断的学习，才能保证检测结果和质量抽检结果的准确可靠。

冷沉淀的质量要求最终还是取决于用途，随着冷沉淀使用范围的改变，冷沉淀的质量要求也应进行相应的调整。 卫生行业标准内科输血（WST622-2018）中，冷沉淀凝血因子的使用范围是：适用于FⅧ和／或FXIII 和／或VWF 和／或纤维蛋白原等缺乏的治疗性输注［14］。 但用于低纤维蛋白原血症或血友病患者的规则都是在药源性纤维蛋白原和药源性FⅧ浓缩物无法获得时输注。 目前针对冷沉淀凝血因子的质量要求，主要关注FⅧ和纤维蛋白原的含量，对于VWF 和凝血因子XIII 重视不够。 国内目前尚无专门治疗血管性血友病患者（VWD）和凝血因子XIII 缺乏患者的血浆制品，出血时治疗的首选是冷沉淀，随着冷沉淀使用范围的改变，我们也应该更重视冷沉淀中的VWF 和凝血因子XIII 的含量。

作者贡献声明房云海负责撰写文章；张心声负责修改文章

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