基于氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠模型评价玉米花丝中性多糖的降尿酸作用

苑 丽 艳， 姜 鹏 飞，2， 祁 立 波，2， 傅 宝 尚，2， 林 松 毅，2

(1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

高尿酸血症(HUA)的发生受血尿酸(UA)水平的调控，当机体内嘌呤代谢紊乱，肾脏UA排泄不足引起体内UA浓度异常增加，高于416 μmol/L 时，即为高尿酸血症[1]，会导致痛风、炎症反应及其他代谢性疾病，心血管疾病、急慢性肾病等的患病概率增加[2-3]。由于生活水平的提高以及人们饮食习惯的变化等，全球越来越多的人患上HUA，且患者呈现明显的低龄化趋势[4]。目前诊治HUA和痛风的有效药物如别嘌呤醇(AP)等均可能导致患者出现严重的恶性反应，甚至死亡[5]。因此寻找具有抗HUA作用且更加安全的活性物质意义重大。

玉米花丝资源丰富、来源广阔，含有多种有益的生物活性成分，在民间常被煮水后饮用治疗肾炎、高血压、糖尿病等疾病，或与其他药物配伍使用治疗痛风[6]。多糖是其最主要的活性成分[7]。研究表明，玉米花丝多糖在利尿、抗糖尿病、降血脂等方面均表现出良好的药理作用，是一种潜在的功能制剂[8-9]。然而，关于玉米花丝多糖对HUA的作用尚未有明确的报道。

本实验以玉米花丝为原料，从中分离纯化得到一种中性多糖，利用氧嗪酸钾(PO)构建HUA小鼠模型，以AP为阳性药物，依据血尿酸(UA)浓度、血清和肝脏黄嘌呤氧化酶(XO)活性、血肌酐(Cr)浓度以及肝脏、肾脏病理学变化考察其体内降尿酸活性，初步分析作用机制，以期丰富降尿酸活性成分组成，为玉米花丝资源的充分利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

干玉米花丝，品种为辽育606，秋季收集自大连仟和市场。清洁级雄性昆明种小鼠(ID SCXK2020-0001)，体重(20±2) g，8周龄，辽宁长生生物科技有限公司；氧嗪酸钾，麦克林有限责任公司；别嘌呤醇，阿拉丁试剂(上海)有限公司；血尿酸、黄嘌呤氧化酶、血肌酐试剂盒，南京建成生物工程研究所；BCA试剂盒，北京索莱科技有限宝公司；DEAE-52纤维素，BXD公司。

CXG-1F层析柜，上海青浦沪西仪器厂；SY-5000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；CR22N高速冷冻离心机，日立工机株式会社；10ND冷冻真空干燥机，宁波新芝生物科技有限公司；Infinite M200多功能酶标仪，瑞士TECAN公司。

1.2 方 法

1.2.1 玉米花丝中性多糖的制备

1.2.1.1 粗多糖的提取

按照Chen等[10]的方法提取粗多糖。精确称取1 g干玉米花丝，利用热水浸提法在料液比1∶100、80 ℃提取90 min。8 000 r/min离心水提液20 min，保留上层溶液，蒸发浓缩，添加乙醇溶液，终体积分数为70%，4 ℃下静止24 h。加入蒸馏水以重新溶解沉淀，冻干后获得水提玉米花丝粗多糖(CCSP)。

1.2.1.2 脱色脱蛋白及透析处理

CCSP经过氧化氢脱色，以体积比1∶0.2添加Sevag溶液(氯仿与正丁醇体积比5∶1)，以去除其中的蛋白质类物质，重复6次，合并所得液体，浓缩去除有机试剂[11]。经流动水和蒸馏水分别透析处理2 d，冻干样品。

1.2.1.3 DEAE-52柱层析

将预先吸水充分溶胀、NaOH/HCl/NaOH溶液分别浸润30 min，用蒸馏水不断冲洗直至中性的DEAE-52纤维素填入规格为Φ3.0 cm×60 cm 的纯化柱中。将脱色脱蛋白并透析处理的CCSP样品重新溶解后装入该纯化柱中，以1 mL/min 的体积流量连续通入蒸馏水，直至无多糖组分被洗脱。该中性多糖组分命名为NCSP，苯酚-浓硫酸法测定其中的多糖类物质[12]。

1.2.2 动物饲养

雄性昆明种小鼠在温度(22±2) ℃、相对湿度(50±15)%、正常暗/光循环(12 h/12 h)条件下适应至少一周，其间自由进食及饮水。

1.2.3 高尿酸血症模型小鼠的构建

根据Zhang等[13]的方法并稍做修改后建立HUA小鼠模型，造模药为PO，阳性药为AP。将小鼠随机分为6组：空白对照组，模型对照组，阳性对照组，NCSP低、中、高剂量组(10、20、40 mg/kg)。正常对照组在7 d内均接受生理盐水处理，其余各组用250 mg/kg的PO处理以诱导HUA。1 h后，正常和模型对照组用生理盐水处理，阳性对照组、NCSP 3个给药组各自给予5 mg/kg的AP和相应浓度的NCSP。处理6 d后，在最终给药处理前12 h将食物撤出。灌胃1 h后，于眼球处采血，检测血液相关指标。颈椎脱臼法处死实验动物，当即分离肝、肾、脾、心并称重。其中一部分肾、肝脏样本处理后进行病理学研究。另取部分肝脏组织用以评价肝脏XO活性。

1.2.4 高尿酸血症小鼠生化指标的测定

依照相应试剂盒的指示说明，评价血UA、Cr水平及血清和肝脏XO活性。

1.2.4.1 血清UA的测定

将5 μL蒸馏水或UA标准溶液(400 μmol/L)或小鼠血清样品与250 μL试剂1混合均匀，37 ℃下保持静止10 min而后检测各样品在510 nm的吸光度。血清尿酸浓度按式(1)计算。

(1)

式中：Ac为小鼠血清样品的吸光度；As为UA标准溶液的吸光度；A0为空白对照(蒸馏水)的吸光度；cs为UA标准溶液浓度，μmol/L。

1.2.4.2 血清和肝脏XO活性的测定

向100 μL匀浆样品中依次加入1.0 mL试剂1、0.05 mL试剂2、0.2 mL试剂3和0.02 mL试剂4，37 ℃水浴20 min。加入1 mL试剂5摇匀后检测各反应液在530 nm的吸光度。血清XO酶活单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟催化产生1 nmol尿酸为一个酶活力单位(U/L)。肝脏XO酶活单位的定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生1 nmol尿酸为一个酶活力单位(U/g)。

(2)

式中：A′c为小鼠血清样品的吸光度；A′0为空白对照(蒸馏水)的吸光度；V为反应溶液总体积，L；Vc为样品体积，L；t为反应时间，20 min；12.6×10-3为尿酸摩尔吸光系数与孔板光径的乘积，mL/nmol。

(3)

式中：A″c为小鼠肝匀浆上清样品的吸光度；A0为空白对照(蒸馏水)的吸光度；V″为反应溶液总体积，L；V″c为样品体积，L；t为反应时间，20 min；12.6×10-3为尿酸摩尔吸光系数与孔板光径的乘积，mL/nmol；cc为肝匀浆上清的蛋白浓度，由BCA试剂盒测定。

1.2.4.3 血清Cr的测定

将6 μL蒸馏水、Cr标准溶液(442 μmol/L)、小鼠血清样品分别与180 μL试剂1混合均匀，37 ℃下温 育5 min，在546 nm处测定吸光度(A1)。继续添加180 μL试剂2，测定吸光度(A2)。血清Cr浓度按公式(4)计算。

(4)

式中：Ac1、Ac2为小鼠血清样品的吸光度，As1、As2为Cr标准溶液的吸光度，k为稀释因子，A01、A02为空白对照(蒸馏水)的吸光度。

1.2.5 数据统计分析

实验结果表示为(均值±SD)。利用单因素方差分析进行数据处理与结果分析，确定统计学差异。利用GraphPad Prism 8.3.0软件进行统计图绘制。

2 结果与讨论

2.1 玉米花丝中性多糖对高尿酸血症模型小鼠生化指标的影响

2.1.1 对高尿酸血症小鼠血尿酸浓度的影响

如图1(a)所示，PO诱导的HUA模型小鼠血清UA浓度与未经药物处理的正常小鼠相比显著增加，二者间存在明显差异(P<0.001)，表明HUA小鼠模型成功建立。与模型对照组相比，阳性药物AP和NCSP低、中、高剂量组血清UA水平均显著下降，分别下降66.67%、45.68%、50.51%和57.56%(P<0.001)，表明NCSP拥有抗HUA的能力，且活性呈剂量依赖。尿酸盐是血浆中主要的抗氧化剂之一，其极低水平长期存在极有可能引发其他疾病，且其与死亡率之间存在U型曲线关系[14-15]。本实验中各剂量的NCSP均未将血清UA降至极低水平，其值与正常对照组接近，提示NCSP具有作为功能食品成分降低血清UA水平、治疗HUA的应用潜力。

2.1.2 对高尿酸血症小鼠血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响

XO是产生UA的关键酶，其活性升高会引起UA水平的升高，抑制该酶活性是阻断体内UA过量合成，并在临床上治疗痛风的有效途径[16]。为了探究NCSP降尿酸作用机制，对XO活性进行测定。如图2(b)和图2(c)所示，模型对照组小鼠血清和肝脏中的XO活性均明显提高(P<0.01)，分别达到9.40 U/L和2.90 U/g，说明经氧嗪酸钾诱导后，在嘌呤分解代谢的最后步骤中负责将次黄嘌呤分解成黄嘌呤、最终产生UA的XO活性被激活并提高。与图1(a)所示PO导致HUA小鼠血清UA浓度明显增加的结果一致。NCSP组血清和肝脏XO活性均随剂量增大而表现出更大程度的减弱，说明NCSP对XO活性具有抑制作用。其中血清XO活性在中、高剂量时分别降低了14.47%(P<0.05)和19.89%(P<0.01)；肝脏XO活性在中、高剂量时分别降低了6.90%和7.24%。提示NCSP能够以降低XO活性阻碍UA产生的方式表现出抗HUA的能力。

(a) 血清尿酸

2.1.3 对高尿酸血症小鼠血肌酐浓度的影响

UA被认为是慢性肾脏疾病发展的潜在危险因素，因此本研究探讨NCSP对小鼠肾脏功能的影响。在实际应用中，血清Cr浓度常用来体现肾功能状况[17]。如图1(d)所示，相较于空白对照组，模型对照组小鼠血清Cr水平显著升高。中剂量和高剂量组能够更好地降低HUA小鼠的血清Cr水平，分别降低了20.07%(P<0.05)和30.02%(P<0.01)，作用效果比阳性药物更好。提示NCSP具有改善肾损害的能力，可能与肾UA清除率增加有关[5]。

2.2 玉米花丝中性多糖对高尿酸血症模型小鼠病理组织学的影响

2.2.1 对高尿酸血症小鼠肾脏组织的影响

肾脏在HUA发生中的作用巨大，70%的UA由肾脏排出，其发生病变会造成UA直接排泄不足，增加血液UA水平，引起HUA[18-19]。如图2所示，空白对照组小鼠肾组织清晰完整，未见病理损伤。模型对照组小鼠肾脏组织形态被破坏，肾小球严重萎缩，肾小管扩张，管腔不规则，说明PO引起了严重的肾损伤。NCSP治疗后，小鼠肾脏结构均有不同程度的恢复，其中高剂量组小鼠的肾脏组织恢复效果更好，该结果与其对UA和Cr浓度的影响一致。说明NCSP通过保护HUA小鼠的肾脏功能，增加肾UA排泄量，减少了模型小鼠血清UA含量。

(a) 空白对照组

2.2.2 对高尿酸血症小鼠肝脏组织的影响

如图3所示，与空白对照组相比，各剂量组小鼠肝组织均不存在变性、肿胀等其他病理学变化，说明NCSP对小鼠无毒性作用。

(a) 空白对照组

2.3 玉米花丝中性多糖对高尿酸血症模型小鼠生理指标的影响

2.3.1 对高尿酸血症小鼠脏器系数的影响

不同剂量多糖对高尿酸血症模型小鼠脏器系数的影响如表1所示。结果表明，多糖对小鼠的肝、肾、心和脾脏系数的影响不存在统计学差异(P>0.05)。说明玉米花丝多糖并未引起小鼠脏器质量明显变化，安全可靠。

表1 不同剂量NCSP对高尿酸血症模型小鼠脏器系数的影响

2.3.2 对高尿酸血症小鼠体重的影响

不同剂量多糖对高尿酸血症模型小鼠体重的影响如表2所示。结果表明，小鼠体重与对照组相比差别不大(P>0.05)。实验期间小鼠无死亡现象，证明3种剂量的玉米花丝多糖对小鼠健康没有显著影响。

表2 不同剂量NCSP对高尿酸血症模型小鼠体重的影响

3 结 论

通过DEAE-52纤维素柱层析法实现了玉米花丝多糖类化合物的分离纯化，研究了其对PO所致HUA模型小鼠的影响。结果表明，纯化的NCSP显著降低HUA模型小鼠体内UA浓度。同时，血清Cr水平显著降低。肾脏组织病理学分析证明NCSP具有较好的减轻肾脏损害的能力。对血清和肝脏中XO活性进行测定，得到NCSP降尿酸作用机制之一是通过抑制该酶活性减少UA产生，从而表现出抗HUA的作用。玉米花丝中性多糖的抗高尿酸血症作用与其抑制黄嘌呤氧化酶活性、减少血尿酸生成、保护肾功能损害促进血尿酸排泄有关。