高效液相色谱法测定酵素中γ-氨基丁酸

刘宗乐， 张展展， 尤晓亭， 高文惠*， 高林森

（1.河北科技大学食品与生物学院，河北石家庄 050000；2.河北省农林科学院农业信息与经济研究所，河北石家庄 050050）

酵素是以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品（索婧怡等，2020）。酵素中含有多种营养成分，如氨基酸、超氧化物酶、多酚、黄酮类物质以及维生素等。γ-氨基丁酸（GABA）是酵素在发酵过程中所产生的功能性成分之一。研究发现，通过GABAA、GABAB和GABAC这三种受体，GABA可以起到调节情绪（Kose等，2017）、改善睡眠质量（Ahyun等，2021）和增强记忆力（Dashniani等，2020）等作用。此外，GABA在癫痫（Suchitra等，2020）、降血压（Ngo等，2019）、糖尿病（Li等，2020）以及一些神经系统疾病（Sarasa等，2020）中发挥着有益作用。GABA在畜禽生产中可以提高机体免疫功能、改善产品品质、提高生产性能等（付兴周等，2018）。酵素具有多种生理功能，应用于畜禽生产中可发挥诸多有益作用（简华峰等，2020），有望成为替代抗生素的新型饲料添加剂。目前，酵素作为一种功能性食品，GABA含量也已经作为评价酵素的特征性指标之一。因此，建立一种简单、灵敏，适用于检测酵素中GABA含量的方法，对提高酵素产品质量具有参考意义。

高效液相色谱法（HPLC）（Weng等，2021）、比色法（汤彩云等，2018）、氨基酸自动分析仪（李放等，2016）、超高效液相色谱-质谱联用法（UPLCMS/MS）（秦 宇 等，2020）、 高 效 薄 层 色 谱 法（HPTLC）（Sancheti等，2013）等是目前参考文献中报道的有关GABA的主要检测方法。与多数氨基酸一样，GABA需要通过衍生化处理来实现对目标物质的定量测定，常用的衍生化试剂有邻苯二甲醛（OPA）（王嘉怡等，2019）、丹磺酰氯（Somasundaram等，2017）、2，4-二硝基氟苯（段智红等，2019）和异硫氰酸苯酯（李敏等，2015）等。本实验拟采用OPA作为柱前衍生化试剂，通过单因素实验，研究衍生时间和衍生温度的影响，优化并选择检测波长、流动相比例和柱温条件，建立一种简单、灵敏，适用于酵素中GABA的定量分析方法，并对实际样品进行检测，为酵素产品的开发以及评价酵素产品质量提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 酵素样品（自制和市售）；GABA标准品（HPLC≥99%），上海源叶生物科技有限公司；OPA，β-巯基乙醇（99%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，色谱纯，天津赛孚瑞科技有限公司；氢氧化钠、结晶乙酸钠、冰乙酸、硼酸，均为分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；实验室用水为超纯水。

1.2 仪器设备Agilent 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；UPT-I-10T超纯水制备机，四川优普超纯科技有限公司；ST3100实验室pH计，奥豪斯仪器有限公司；KH5200超声波清洗仪，昆山禾创超声仪器有限公司；SHB-3A循环水式多用真空泵，郑州杜甫仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的配制GABA标准溶液的配制：准确称取20.0 mg GABA标准品用水溶于10 mL容量瓶中，定容，得到2 mg/mL的母液，并依次稀释为0.0001、0.0003、0.05、0.1、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的系列标准溶液，置于0～4℃保存备用。

硼酸缓冲液的配制：称取2.47 g硼酸溶于85 mL水中，用氢氧化钠调pH=10.4，定容至100 mL，置于0～4℃保存备用。

OPA衍生液的配制：准确称取10.0 mg OPA，超声溶解于2.5 mL乙腈中，再加入β-巯基乙醇20 μL，置于0～4℃避光保存。

1.3.2 样品处理 根据需要将不同酵素样品稀释一定倍数后，过0.22 μm有机滤膜，待检测使用。

1.3.3 衍生方法 由于GABA本身无紫外吸收，故标准溶液和样品溶液中的GABA需要进行衍生化处理，进而实现定量测定目标物质的目的。本实验采用OPA作为柱前衍生化试剂，使OPA与GABA在pH=10.4的硼酸缓冲液反应体系下发生衍生化反应，生成具有紫外吸收的物质，但该生成物的稳定性差。因此，实验对衍生时间和衍生温度的影响进行了考察。

操作流程：在室温下，用移液枪分别量取1.3.1配制的硼酸缓冲液600 μL、OPA衍生液120 μL以及GABA标准溶液或样品溶液120 μL，混合，控制反应时间为2 min，过0.22 μm有机滤膜后，量取20 μL，立即进样分析检测。

1.3.4 色谱条件 色谱柱：XBridgeRC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测波长：334 nm；流动相A：乙腈，流动相B：20 mmol/L结晶乙酸钠溶液（冰乙酸调pH=7.3），A:B=20:80（体积比）；流速：0.8 mL/min；柱温：25℃；进样量：20 μL。

1.3.5 衍生时间的影响 在室温条件下，选取同一质量浓度的GABA标准溶液进行衍生化处理，控制反应时间分别为1、2、3、4、5、6 min和7 min，按照1.3.4色谱条件快速进样分析检测，以考察衍生时间对峰面积的影响。

1.3.6 衍生温度的影响 选取同一质量浓度的GABA标准溶液分别在室温、35、45、55℃和65℃下进行衍生化处理，控制反应时间为2 min，按照1.3.4色谱条件快速进样分析检测，以考察不同衍生温度对峰面积的影响。

1.3.7 检测波长的选择 按照1.3.3方法对GABA标准溶液进行衍生化处理，衍生化反应所生成的物质在1.3.4色谱条件下经过C18柱分离后进入二极管阵列检测器进行光谱扫描，得到GABA衍生物的紫外吸收光谱图后，根据紫外吸收和实际分离情况选择最适检测波长。

1.3.8 流动相比例的选择 在上述最佳衍生条件及固定色谱柱温度为25℃，且其他色谱条件不变，设置流动相乙腈与20 mmol/L结晶乙酸钠的体积比为25:75、22:78、20:80和19:81，分别对标准溶液和样品溶液中GABA进行洗脱分离，考察流动相比例对分离情况的影响，以确定最佳流动相比例。

1.3.9 柱温的选择 在上述最佳衍生条件及固定流动相为乙腈-20 mmol/L结晶乙酸钠溶液（体积比20:80），且其他色谱条件不变，设置柱温为25、30、35、40℃，分别对标准溶液和样品溶液中GABA进行分析检测，考察柱温对分离效果的影响，以确定最佳柱温条件。

1.3.10 线性关系与检出限 在室温条件下，对1.3.1配 制 的 质 量 浓 度 为0.0003、0.05、0.1、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的系列GABA标 准溶液进行衍生化处理，控制反应时间为2 min，按照1.3.4色谱条件进样，测得相应质量浓度下GABA衍生物的峰面积，以考察质量浓度与峰面积的线性关系。将GABA标准溶液依次稀释，采用建立的方法进样检测，并以基线噪声的3倍确定其检出限。

1.3.11 回收率和精密度的测定 在质量浓度为0.001、0.01、0.1 mg/mL 3个添加水平下，进行加标回收率和精密度实验。取稀释一定倍数后的酵素样品，分别添加上述质量浓度的标准溶液，按照

1.3.3 方法对加标样品进行衍生化处理，在1.3.4色谱条件下进样检测。在上述条件下，各加标样品重复进样5次，记录数据，根据线性回归方程计算回收率和相对标准偏差。

1.3.12 实际样品的测定 采用实验建立的方法分别对6种自制或市售的酵素样品进行检测，根据所测得的峰面积，计算样品中GABA的含量。

2 结果与分析

2.1 衍生时间的影响 由图1可知，在所考察的衍生时间范围内，当衍生时间增加，GABA衍生物的峰面积总体呈现先增加后降低的变化趋势。在衍生时间为2 min时，检测灵敏度最高，对应GABA衍生物峰面积最大。因此选取2 min作为衍生化时间，且实验需要快速进样。

图1 衍生时间对GABA衍生物峰面积的影响

2.2 衍生温度的影响 由图2可知，在不同衍生温度下，对应GABA衍生物峰面积间有着明显差异。在所考察的衍生温度范围内，当衍生温度升高时，由于OPA与GABA的衍生化产物稳定性较差，GABA衍生物的峰面积呈下降的变化趋势。因此，选取室温作为最佳衍生化温度。

图2 衍生温度对GABA衍生物峰面积的影响

2.3 检测波长的选择GABA衍生物经C18柱分离后进入二极管阵列检测器在210～400 nm内进行光谱扫描，结果见图3。GABA衍生物有2处特征吸收，分别为228 nm和334 nm。在最佳衍生条件下，设置波长分别为228 nm和334 nm，固定其他色谱条件不变，进样分析检测。发现在GABA衍生物响应值高的228 nm波长下，干扰峰较多。考虑紫外吸收和实际分离情况，选择334 nm作为检测波长。

图3 GABA衍生物的紫外光谱扫描图

2.4 流动相比例的选择 实验考察了流动相乙腈与20 mmol/L结晶乙酸钠为不同比例时，酵素样品中目标物质与其他成分的分离情况。酵素样品在4种流动相比例（乙腈与20 mmol/L结晶乙酸钠的体积比为25:75、22:78、20:80和19:81）下的高效液相色谱分离图如图4所示。结果表明，当流动相中乙腈比例从25%到19%的过程中，随着乙腈比例的降低，目标物质的保留时间逐渐增长。当流动相A与B比例为25:75时，样品中杂质与目标物质的色谱峰重叠严重；当流动相A与B比例为22:78时，目标物质与杂质色谱峰不能完全分离；当流动相A与B比例为20:80时，目标物质可以实现基线分离，且无拖尾现象；当流动相A与B比例为19:81时，样品中杂质与目标物质的色谱峰完全分离，但分析时间较长。综合考虑，选择体积比为20:80的乙腈-20 mmol/L结晶乙酸钠作为流动相。

图4 流动相比例的选择

2.5 柱温的选择 实验考察了不同柱温条件下，酵素样品中目标物质与其他成分的分离情况。酵素样品在4种柱温（25、30、35℃和40℃）条件下的高效液相色谱分离图如图5所示。结果表明，当色谱柱温度为40℃和35℃时，样品中杂质与GABA衍生物的色谱峰分离效果不佳。当色谱柱温度为30℃和25℃时，目标物质均可以实现基线分离。虽然在柱温30℃较25℃时，目标物质的保留时间有所提前，但考虑到样品基质的影响，为确保样品中杂质与GABA衍生物更好的分离，选用接近室温的25℃作为柱温。

图5 柱温的选择

2.6 线性关系与检出限 按照1.3.10方法对GABA质量浓度与峰面积的线性关系进行考察，以质量浓度为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线（图6）。GABA标准品的高效液相色谱图见图7。质量浓度在0.3 μg/mL～1 mg/mL线性关系好（R2=0.9997），并且线性范围宽，线性回归方程为y=11245x-73.995。以信噪比S/N=3确定检出限为0.1 μg/mL。

图6 GABA衍生物的标准曲线

图7 GABA标准品的HPLC色谱图

2.7 回收率和精密度的测定 按1.3.11方法进行回收率和精密度实验，结果见表1。酵素样品的平均加标回收率为92.17%～104.29%，相对标准偏差（RSDs）为0.51%～3.99%（n=5）。结果表明，实验建立的方法准确度和精密度良好，分析方法可靠，且适用于酵素产品中GABA含量的检测。

表1 方法的回收率和精密度（n=5）

2.8 实际样品的测定 按照1.3.12方法分别对自制和市售的6种酵素样品进样检测，并计算样品中GABA的含量，结果见表2。结果表明，所测6种酵素样品中均含有GABA，且含量在0.036～0.567 mg/mL。由于所测酵素样品原材料、发酵工艺等方面的不同，使各酵素样品间GABA的含量具有明显差异。6种酵素样品的高效液相色谱分离图，如图8所示。结果表明，采用实验建立的方法，酵素样品中目标物质与其他成分具有良好的分离效果，而且该检测方法较其他方法简单（汤彩云等，2018）、灵敏（李雁琴，2020；陈雪等，2017；李璐，2016）。

图8 酵素样品的HPLC色谱图

表2 6种酵素样品中GABA含量mg/mL

3 结论

本实验结果表明，以OPA作为衍生化试剂，在室温下进行衍生化处理，控制反应时间为2 min，按照检测波长334 nm，流动相为乙腈-20 mmol/L结晶乙酸钠溶液（体积比20:80），柱温25℃，流速0.8 mL/min的色谱条件快速进样分析检测，目标色谱峰分离效果好，质量浓度在0.3 μg/mL～1 mg/mL线性关系好（R2=0.9997），且线性范围宽，检出限为0.1 μg/mL，准确度和精密度良好，所检测的6种酵素样品中GABA含量在0.036～0.567 mg/mL，不同酵素样品间GABA含量具有明显差异。实验建立的方法简单、灵敏、准确可靠，适用于酵素产品中GABA含量的检测。