N6-甲基腺苷甲基化在心血管相关疾病中的研究进展*

范雪，徐明国

中国医科大学附属深圳市儿童医院心血管内科(广东深圳 518038)

近年来，转录后修饰已成为生物科学研究的热点,目前已有171种RNA转录后修饰被鉴定出来[1]。高达80%的RNA甲基化是由N6-甲基腺苷(N6- methyl adenosine, m6A)介导的，在mRNA近终止密码子和3端非翻译区出现集中现象[2]。m6A参与了mRNA的翻译、降解、剪切、输出和折叠等大部分的RNA代谢过程[3-4]。已有研究证明，m6A修饰及其相关酶在mRNA生命的不同阶段发挥重要作用[5]，参与了人类复杂疾病的发生过程，在心血管疾病的发生发展中也起到了重要作用。在本文中，重点总结了m6A修饰的研究进展，在心血管疾病中m6A甲基化的相关机制和功能以及今后主要的研究方向。

1 m6A修饰与相关蛋白

RNA的m6A 甲基化是腺嘌呤(A)第6位N通过甲基转移酶催化形成的一种甲基化修饰[6]，近年来,研究表明m6A酶系统主要由3种蛋白组成，包括甲基化酶、去甲基化酶以及m6A阅读蛋白[7]。

1.1 m6A与甲基化酶 第一类是负责催化m6A甲基化的writers，能够将甲基化修饰写入RNA中，此过程是经由甲基转移酶复合体介导的。它的主要内容是甲基转移酶3(methyltransferase-like 3，METTL3)和甲基转移酶14(methyltransferase-like 14，METTLl4)，随后以又出现了Wilms′瘤相关蛋白、甲基转移酶16、RNA结合模体蛋白1、锌指结构域包含蛋白13等。其中，METTL3是最早发现的写入基因，属于S-腺 苷 甲 硫 氨 酸 结合蛋白，具有催化mRNA发生m6A修饰的功能，METTL14是MT-A70甲基转移酶家族中与METTL3具有同源性的异二聚体,可以促进与 RNA的结合[8-9]，两者以1∶1的比例形成稳定的异源二聚体，即Mettl3-Mettl14复合体，在此过程中发挥协同作用。Wilms′瘤相关蛋白本身无甲基转移酶活，有研究显示，它可能起引导作用，使METTL3-METTL14异二聚体在核斑中定位，从而促进m6A沉积，并且识别共有基序RRACH[10]，影响细胞RNAm6A负荷，保证Mettl3-Mettl14复合体发挥催化作用。METTL16是近年新发现的m6A甲基转移酶，其作用方式与 METTL3和METTLl4明显不同,能以单一组分进行催化，影响m6A的形成[11]。另外有报道称，锌指结构域包含蛋白13可以将Wilms′瘤相关蛋白固定存在于核内,保证核定位，使转录合成的mRNA甲基化的顺利进行[12]。

1.2 m6A与去甲基化酶 第二类是负责将RNA甲基化修饰信号擦除的erasers，主要功能是介导RNA的去甲基化修饰过程，它的内容主要包括脂肪量与肥胖相关蛋白(fat mass and obesity associated protein，FTO)和Fe(Ⅱ) 和-KG依赖的双加氧酶AlkB家族成5[AlkB family of nonheme Fe(Ⅱ)/-ketoglutarate(-KG)-dependent dioxygenases 5.ALKBH5][13]。FTO是最先被人们发现与肥胖相关的m6A去甲基化酶，位于第16号染色体(16q12.2)并广泛存在于成人和胚胎的组织中，最近的一项研究表明，FTO能去除m6A甲基修饰，将细胞内m6A去甲基化，且当受抑制时能够增高整体mRNA的m6A修饰水平[14]。研究中发现ALKBH5主要集中在核散斑中，通过将已经m6A修饰的mRNA发生去甲基化，参与调控mRNA相关的代谢过程[15]。

1.3 m6A与阅读蛋白 第三类是与RNA中的m6A甲基化位点结合进而发挥不同下游效应的readers[16]。它们是含有YTH结构域的蛋白家族成员，包括YTHDFs和YTHDCs两个亚型，都具有保守的m6A结构域，可以通过直接结合甲基化修饰的靶基因在细胞核以及细胞质中参与下游RNA的翻译、降解等过程。据报道，YTHDF1蛋白可以将翻译起始因子募集，进一步加快m6A甲基化mRNA的翻译效率[17]，YTHDF2 蛋白与 m6A 位点结合使mRNA 的半衰期缩短，促进mRNA的降解[18]。YTHDC1通过影响mRNA剪接，mRNA输出以及特定转录本的衰变在细胞核中发挥调控作用[19-20]，YTHDC2广泛存在于核内、外，具有螺旋酶和蛋白重复结构域，能够选择性地与非编码 RNA 上的 m6A 位点结合，通过解旋酶作用可以提高翻译效率，同时降低mRNA的丰度[21]，随后又发现了真核起始因子3 (eIF3)，能与m6A的mRNA 5′UTR直接结合，是非常复杂的起始因子[22]，还有人胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白，可以通过识别共有序列GG(m6A)C，作用于mRNA 转录本，进一步增强mRNA 的稳定性和翻译效率[23]。近年来还发现了人异质性细胞核核糖蛋白C，它不与m6A直接结合的蛋白，通过与结构改变的RNA结合，促进这些 RNA的加工转运，参与mRNA的转录和成熟等过程[24]。

1.4 m6A与检测方法 近年来随着人们对m6A的认识和深入研究，其检测方法也在不断进步，传统技术中薄层色谱、高效液相色谱和斑点杂交法均无法确定其在mRNA转录本中的位置，局限性很明显。斑点杂交技术在分子生物学中用于DNA、RNA和蛋白质样品的半定量或定量检测方法，主要是对m6A的半定量检测，缺点是它只能验证m6A的存在或进行不同组间m6A含量的比较[25]。2012年出现了高通量测序与抗体免疫沉淀相结合的方法[26]，之后又出现了光交联辅助m6A测序技术[27]，该技术可以提高m6A位点的分辨，除此之外，还有两个相似的技术分别为miCLIP和m6A-CLIP[28-29]。生物信息学的快速发展使其在m6A的甲基化位点的预测方面也得到了广泛应用，最早提出的是隐藏马尔科夫模型来预测已知位点周边的残余位点[30]，随后又开发了pRNAm-PC 方法、iRNA-Methyl 方法、RNA-methylPred 方法、TargetM6A 方法，技术也在逐渐的提高，使预测过程更快速、稳定[31-34]。目前来看，m6A的检测方法有限，需要更深入的研究，进一步认识m6A的作用机制和生物学功能。

2 m6A与心血管疾病

随着m6A相关检测技术以及表观遗传学研究领域的逐步深入，m6A mRNA甲基化与心血管疾病的关系逐渐成为人们的关注热点，目前的研究表明RNA m6A转录后修饰在多种病理生理过程中起着关键作用，且与心血管疾病的发生发展密切相关。

2.1 m6A与主动脉瘤 主动脉瘤在临床上以腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)最为常见，AAA是指腹主动脉的局限性瘤样扩张，其管腔直径超过3 cm或超过正常直径的1.5倍，是一种慢性炎症血管性疾病，如出现破裂，病死率可达到90%[35]。AAA瘤壁组织的病理改变包括慢性透壁性炎症、细胞外基质破坏性重构、血管平滑肌细胞凋亡等。

研究表明,许多经典受体以及补体等先天免疫系统均参与了AAA的形成[36]。目前临床还没有发现能够有效抑制AAA发生、发展的药物，手术治疗是AAA唯一有效的治疗方法[37]。近年来的研究工作者主要把关注点放在如何延缓AAA的发展上，这可能对疾病是一种潜在的治疗手段。研究发现，METTL3可以激活与AAA联系密切的经典信号通路NF-κB[38-39]。m6A修饰可以介导miRNA前体加工，METTL3可以促进这一过程的发展，进而使成熟的微小RNA数量增加[40],进一步研究证实，miRNA通过抑制靶基因在AAA各种病理生理过程中的表达起着重要的作用[41]。He等[42]研究发现，YTHD3、FTO和MTTTL14在内的m6A调节因子在人类AAA发病机制中有重要作用，提示了临床AAA表观遗传学改变的潜在机制。

2.2 m6A与心室重塑 心室重塑是心室肌细胞对多种刺激因素的复杂反应，持续的压力负荷过重、容量负荷过重以及基因突变可以产生病理性心肌重塑, 临床均可表现为心肌肥厚。当心脏受到损伤时，心肌细胞不能完成分裂，数量不会增加，表现为细胞体积增大、心室壁增厚和心肌纤维排列紊乱等肥厚表型[43]。临床中常见的病理性心肌肥厚是指心脏发生了重构，此过程与基因表达和转录后修饰的变化有关[44-45]。心肌肥厚发病是复杂的，涉及多种细胞信号通路之间的复杂相互作用，其机制尚不完全清楚,持续进展往往导致心力衰竭和猝死等不良事件的发生。有研究发现， METTL3介导了成肌细胞中的m6A修饰，影响了mRNA 水平，利于肌肉的生长发育[46]。近年来有报道，METTL3 是一种最早被鉴定出的m6A甲基转移酶，在肥厚刺激下增强，是心肌细胞正常肥厚反应的必要条件，增强的m6A RNA甲基化导致代偿性心肌肥厚，而减弱的m6A导致偏心性心肌细胞重构和障碍, 同时证明了心肌细胞中m6A的发生且在肥大条件下会发生动态变化[47]。有研究发现，FTO基因的传递可以减弱缺血诱导的心脏重构，通过增加RNA中的m6A,进而降低心肌细胞的收缩功能，提示FTO调控的m6A机制在心脏重构和修复中的重要功能，同时还与心脏缺陷的发生有关[48]。

2.3 m6A与心肌纤维化 心肌纤维化是指由于心肌组织结构中胶原纤维的变化，引起细胞外基质分泌增加及过度沉积，出现瘢痕组织形成，致使心脏处于非正常的生理功能状态中。在心肌纤维化的过程中心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及炎症细胞均发挥了作用[49]。心肌纤维化可以改变心肌的结构，导致心脏功能障碍和心律失常的发生，进而影响心力衰竭患者的结果和预后[50]。近年来随着高通量甲基化测序等新技术体系的不断更新，发现其调控机制在心肌纤维化的相关基因表达调控中发挥了重要作用，提供了新的有效手段。有研究发现，METTL3沉默后，心肌纤维化相关基因的m6A修饰和细胞稳定性，特别是胶原相关基因的表达和m6A水平发生改变，提示METTL3沉默可以通过抑制心肌成纤维的活化来减轻心肌梗死引起的心肌纤维化[51]。另一研究中，我们确定了线粒体功能与FTO的肌源蛋白表达之间是存在一定联系的，并提示FTO可以调控肌源性分化，同时还参与了心脏的保护机制[52]。最近的一项研究也证明了，FTO的确参与了心肌纤维的调控[48]。这些研究表明m6A修饰与心肌纤维化的发生发展有重要联系，但是能否成为心肌纤维化相关疾病的诊断标志物和治疗靶标尚不清楚。

2.4 m6A与心力衰竭 心力衰竭是由于各种严重心脏疾病引起心肌结构和功能的变化，导致心室充盈和射血障碍，进而出现一系列不良的临床后果[53]。表观遗传过程的失调和异常的基因表达是心力衰竭的重要机制。Mathiyalagan等[48]报道了m6A甲基化参与心肌梗死周围区域的再生，Dorn等[47]和Kmietczyk等[54]也发现了METTL3敲除小鼠肥厚反应的改变导致了心力衰竭的发生。最近一项研究发现，心肌细胞限制敲除RNA去甲基酶FTO的小鼠表现出心脏功能受损，m6A RNA甲基化改变的RNA主要与代谢和调控途径有关，会影响基因表达调控非常早期的步骤，RNA表达水平的改变主要表现为结构可塑性的改变，提示了m6A RNA甲基化改变会引起蛋白质丰度的变化，与mRNA水平无关，因此，m6A RNA甲基化可能对心脏表型产生更大的影响，该过程可能是一个潜在的治疗靶点[55]。

2.5 m6A与高血压 高血压的主要表现是动脉血压高于正常范围，常伴有心脏、血管等重要器官病理性改变的临床综合征，有较高的患病率，西欧国家的发病率为44%，北美国家为28%[56]，其病情进展慢，容易并发靶器官受损的发。最近，人们发现m6A在RNA的动态调控过程中参与了脂肪生成、细胞分化、免疫和炎症反应等，在肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等代谢性疾病的发生过程中发挥重要作用[57]。有研究报道，大约10%血压相关的m6A单核苷酸多态性与冠状动脉疾病或中风有关，结果表明，m6A可能在BP调控中发挥重要作用[58]。另一研究中发现，大量自发性高血压大鼠周细胞的平均m6A在周细胞中表现出全身性的降低，揭示m6A参与了高血压发展过程，同时确定了哺乳动物高血压形成过程中的一个表位切割机制[59]。目前，m6A在高血压中的甲基化作用尚未完全阐明，待进一步研究。

2.6 m6A与其他心血管相关疾病 m6A是真核生物中最丰富的RNA修饰，近年来，越来越多的证据证明m6A修饰能够从生命的起始阶段就对mRNA的生成产生影响，对基因的表达发挥着关键调控作用。有研究，经缺氧/复氧处理细胞中，沉默METTLE3可以增强自噬，抑制其凋亡，增强METTL3表达或抑制ALKBH5表达的作用是相反的，提示m6A甲基化和其调节因子之间的功能研究为局部缺血性心脏病的治疗提供了新方向[60]。另一研究中发现钙化动脉和硫酸吲哚氧基诱导的动脉平滑肌细胞中METTL14的表达增加，从而增加了RNA中m6A水平，降低了血管修复功能，减少METTL14的钙化动脉中表达，减少动脉粥样硬化引起的m6A增加和动脉平滑肌细胞钙化减少，证实了METTL14依赖性血管m6A甲基化在钙化过程中血管功能中的重要功能性[61]。冷燕等[62]发现利用高葡萄糖刺激增强FTO表达，可引起m6A的降低和FOXO1表达升高，且FOXO1是糖脂代谢和心血管内皮细胞发育过程中的重要参与者。

3 结语与展望

近年来，越来越多的证明表明，m6A修饰在基因调控和心血管疾病发展中具有重要作用， RNA中的m6A甲基化水平与细胞内写入、擦除基因的表达水平密切相关，读取基因表达的蛋白分子则与m6A甲基化位点相关，揭示了m6A修饰相关酶可能为心血管系统疾病提供了潜在治疗靶点，需进一步挖掘心血管疾病的分子生物学机制。随着过去几年里，m6A检测技术的进步，使我们对m6A的作用机制产生了新的认识，解释了m6A与mRNA代谢之间的关系，尽管m6A 在心血管系统中的作用已经逐渐被揭示，但很多疾病的其分子作用机制仍不明确，许多关键问题还需进一步研究。深入解释m6A 甲基化修饰在心血管系统发生发展中的调节机制将有助于解决疾病的诊断、治疗及预后判断，为今后m6A的靶向治疗心血管系统疾病提供了科学依据。

利益相关声明:论文所有作者共同认可论文无相关利益冲突。

作者贡献说明:范雪进行了起草论文及文献查阅，徐明国进行了论文修改和指导工作。