弥漫大B细胞淋巴瘤的临床及分子分型研究进展*

陈婷婷， 张新友， 周继豪

暨南大学第二临床医学院血液内科(广东深圳 518000)

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuselarge bcell lymphoma，DLBCL)是一组在细胞形态、免疫表型、分子生物学、临床特点以及治疗反应等诸多方面表现出高度异质性的肿瘤[1]。如何对DLBCL这种特殊的非霍奇金淋巴瘤(NHL)进行合理的分类以指导精准治疗，是淋巴瘤研究领域的热点话题，本文将结合基因表达谱技术、免疫组织化学及基因突变谱技术的进步，就近年来DLBCL的临床和分子分型方面的研究进展进行综述。

1 DLBCL基因表达谱分类

基因表达谱技术(gene expression profiling，GEP)是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段。该技术出现后成为基因组及后基因组时代科学研究的重要手段。GEP揭示了决定淋巴瘤生物学和临床行为的关键分子事件，开启了DLBCL精准分型的时代[2-4]。2000年，Alizadeh等[5]学者采用cDNA微阵列技术，通过分析B细胞分化不同阶段的标志性基因表达的模式，首次将DLBCL区分为两个亚型，一种表达生发中心B细胞(GCB)特征性的基因；第2种表达基因通常是在外周血B细胞体外活化(ABC)过程中诱导表达的基因。GCB亚型DLBCL的患者预后显著优于ABC亚型的患者。2002年Rosenwald等[6]学者使用cDNA芯片检测240例DLBCL患者应用以蒽环类为基础化疗方案治疗前的基因表达情况并分析基因组异常，不仅同样得出结论GCB亚型预后优于ABC亚型，还提出了第3型(type3)的概念，所谓第3型的DLBCL无法用细胞起源来分型，其基因表达谱特性介于GCB亚型和ABC亚型之间，至于第3型能否作为独立分型，现在仍存在争议。这种基于GEP分析，从而确定DLBCL肿瘤细胞起源的分型方法，被称为COO(cell of origen)分型。

虽然GEP开创了DLBCL分型的新时代，但是在面向临床推广应用的过程中，研究人员却发现了一系列的困难。首先，微阵列技术需要新鲜或冰冻标本以提取足够的RNA，但临床上往往难以保证标本送检的时效性。2012年，Barrans等[7]学者建立了从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织中提取RNA和反转录cDNA的方法，使得临床石蜡包埋标本也可以进行GEP分析；其次，基因表达谱检测建立在基因芯片的基础上，由于传统的基因芯片技术要求核酸量较多，且价格昂贵，所以GEP技术也难以在临床推广。2014年，Scott等[8]学者首次报道利用NanoString数字基因定量技术对石蜡包埋组织的基因表达谱进行检测。该技术可直接检测探针标记的单个mRNA转录子并进行定量，所需RNA量少、无需酶促反应和PCR扩增过程，适合大批量检测，敏感性和准确性与实时荧光定量PCR相当，因此特别适用于临床样本的基因表达谱检测。研究者设计了针对20个基因表达的Lymph2Cx表达谱芯片，可对石蜡包埋标本进行精确的表达谱分析，与传统基因芯片方法的检测一致性达到98%以上。但是，一方面，Lymph2Cx所涉及的基因是基于高加索人种DLBCL患者而得出的实验室结果，在中国患者中的准确性仍有待验证；另一方面，由于该设备和耗材仍然相对昂贵，保养维护困难，且目前国内缺乏相应的收费标准，因此也尚未在临床上广泛普及。

2 DLBCL免疫组织化学分型

虽然基于基因芯片法的基因表达谱分析是DLBCL分型的金标准，但是由于前文提及的缺陷，其难以在临床上推广普及。为了将GEP分型的结论以廉价简便的方式应用于临床，有学者致力于利用免疫组织化学染色(IHC)的方法，通过建立特殊算法来间接提示GEP分型，从而指导临床实践[3]。2004年Hans等[9]学者以cDNA微阵列为金标准，使用3个分子标志物：CD10、BCL6及MUM1/IRF4进行分类：CD10(+)为GCB类，当CD10(-)且BCL-6(-)则为non-GCB类：若CD10(-)且BCL-6(+)则需检测MUM1/IRF4，若MUM1(+)则为non-GCB类，反之为GCB类DLBCL。该研究发现入组患者中42%是GCB亚型，58%被认为是non-GCB亚型，且Hans法分类与临床预后密切相关，GCB组和non-GCB组5年OS率分别为76%和34%。以上结论与使用cDNA微阵列作为金标准得出的结果一致性高达86%。之后Choi等[10]学者使用CD10、BCL6、MUM1、GCET1和FOXP1这5个生物标记抗体对接受R-CHOP方案一线治疗的DLBCL患者进行分类，新加入的GCET1抗体既可以区别GCB亚型和non-GCB亚型，同时也提示DLBCL较好的临床预后。FOXP1抗体是非NHL重现性染色体易位的靶点之一，该蛋白高表达提示预后不良。Choi分类能预测的GCB亚型的3年OS率为87%，而non-GCB亚型3年OS为44%。Choi分类与GEP的一致性为93%，显著高于Hans法的84%。因此Choi法能更加准确地预测DLBCL患者的风险分层。但是Choi分类需要5种抗体，其中GCET1和FOXP1这两种抗体在大多数病理科免疫组织化学实验室不常用，所以此分类方法在临床上应用较为困难。此外，2011年，Meyer等[11]学者又提出了Tally分类，该分类使用了5种标志物：CD10、GCET1、FOXP1、MUM1 和 LOM2，其与 GEP的一致性高达93%，也优于Hans法。但是类似于Choi分类，一方面Tally分类中使用的3种生物标记物GCET1、FOXP1和 LM02在很多免疫组织化学实验室中并不常备；另一方面由于部分肿瘤组织对GCET1、FOXP1和LM02三类抗体会显示高背景或非特异性染色，导致不同的实验室对这3个抗体染色结果的判读缺乏统一标准，所以Tally法也没有能够得到广泛采用。

目前Hans法仍然是免疫组织化学判断COO分型的主流手段。美中不足的是，首先，以上介绍的3种主要的免疫组织化学分型来源的主要研究对象是西方人群，而在西方人群中GCB亚型所占比例高于亚洲人群；其次，以上介绍的COO分型方法，入组分析的都是利妥昔单抗时代之前的病例，接受利妥昔单抗治疗的病例比例较低。因此对于采取R-CHOP方案一线治疗的亚洲DLBCL患者来说，DLBCL分子亚型对其治疗结果的预测作用是否一样准确，目前仍存在争议[9]。例如Lee等[12]学者就曾经通过IHC和Lymph2Cx两种方法，对384例东南亚地区DLBCL患者的COO分型的预后进行了单中心回顾性分析。所有患者都接受R-CHOP样方案一线治疗。结果发现Hans分类的non-GCB型和 GCB型的5年OS率分别为70%和71%，而Lymph2Cx方法区分出的ABC型与GCB型的5年OS率分别为74%和92%。Hans分类的non-GCB型和GCB型的5年PFS率分别为65%和70%；而Lymph2Cx方法的ABC型与GCB型的5年PFS率分别为64%和86%。该研究提示在如今利妥昔单抗治疗时代的东亚人群患者中，Hans法确定的细胞起源不一定有明确的预后意义，而通过Lymph2Cx的亚型分析则同样显示出GCB亚型具有更好的PFS和OS率。

3 DLBCL基因突变谱分型

随着二代测序技术的进步，各种研究发现在DLBCL样本中存在大量重现性突变，且鉴定出多个淋巴瘤相关驱动基因突变[13-14]。研究者逐渐认识到，基因表达谱的不同，其内在本质是源于基因突变谱上的差异[15]。因此，在COO分型的基础上，研究者开始探索基于基因突变谱的分型方法，希望更深入揭示不同DLBCL亚型的分子生物学本质[16]。2018年，Schmitz等[17]学者发现根据基因突变、易位及拷贝数异常等特征，DLBCL可以分为不同的基因亚型。为了验证这个结论，学者们收集了574例DLBCL患者的新鲜冰冻活检标本，基于阵列的DNA拷贝数分析和372个基因的深度扩增重测序，使用外显子和转录组测序技术来识别具有重现性突变的基因，最终确定了4种相对独立的基因亚型，分别命名为MCD型(基于MYD88L265P和CD79B共突变为特征)、BN2型(基于BCL6融合及NOTCH2突变为特征)、N1型(基于NOTCH1突变)和EZB型(基于EZH2突变及BCL2易位)。且进一步发现，不同的COO亚型往往对应于不同的基因突变谱亚型。在GCB亚型中，EZB型的比例较高，而MCD型和N1型更常见于ABC亚型，BN2型在ABC、GCB及type3型均可发现。这些不同基因亚型的患者在接受一线R-CHOP方案免疫化疗后在PFS率和OS率方面存在显著差异：BN2和EZB亚型病例预后良好，而MCD和N1亚型病例预后不佳。MCD、N1、BN2和EZB亚型的预测5年OS率分别为26%、36%、65%和68%。多变量分析发现，不同基因亚型间的IPI评分差异其实并不显著，但新的基因亚型分类能独立地预测DLBCL患者的生存率。

同Schmitz几乎同一时间，Chapuy等[18]学者对304例B细胞淋巴瘤患者的低频重现性突变、体细胞拷贝数改变和结构变异进行聚类分析，整合基因驱动因素，最终确定了5种大B细胞淋巴瘤亚群。C1型多属于ABC亚型，主要为TNFAIP3、NOTCH2、SPEN、CD70、B2M、PD-1配体突变及BCL-6、BCL-10易位，多与边缘区淋巴瘤相关[19-20]；C2型与ABC、GCB亚型无关，主要为TP53双等位基因失活、9p21.13/CDKN2A和13q14.2/RB1的拷贝丢失，从而影响染色体稳定性和细胞周期[21]；C3型多属于GCB亚型，主要为BCL2、CREBBP2、EZH2、KMT2D及TNFRSF14突变，多见于de novo GCB型DLBCL和滤泡型淋巴瘤[22]；C4型多属于GCB亚型，主要为多种免疫逃逸分子(CD83、CD58和CD70)、BCR/Pi3K信号中间体(RHOA、GNA13和SGK1)、NF-κB修饰因子(CARD11、NFKBIE和NFKBIA)和RAS/JAK/STA T通路 (BRAF和STAT3)发生突变，多见于滤泡性淋巴瘤[22-24]；C5型多属于ABC亚型，主要为BCL-2、CD79B、MYD88L265P、PIM1、BTG1和ETV6突变，多见于原发中枢神经系统及睾丸DLBCL[25-26]；C0型(少数病例无法分到C1～C5型中)主要为炎症或者免疫细胞弥漫性浸润，但缺乏明确的遗传驱动因素，多见于富于T细胞或组织细胞的大B细胞淋巴瘤[27]；研究表明不同亚型之间的预后指数也存在明显差异，如同属于ABC亚型的C1和C5亚型，C1型的PFS率优于C5型，而同属于GCB亚型的C3型和C4型，C4型的PFS率明显高于C3型。综上所述，这项研究从基因水平上更加精细地区分了GCB和ABC亚型，从而得知C0、C1和C4亚型患者的预后较好，而C2、C3及C5亚型，尤其是C3、C5这两个亚型预后更差。

2020年，Wright等学者将以上两项的2018年基因谱分析文献结果汇总分析[17-18]，针对DLBCL的遗传亚型进一步建立了LymhGen算法。这种基因亚型的概率分类方法是根据DLBCL的致癌途径、基因表达表型、肿瘤微环境、治疗后存活率及潜在治疗靶点，在先前Schmitz的4种基因分类基础上作了补充，增加了A53亚型(具有TP53失活的非整倍体)和ST2亚型(以SGK1、TET2及P2RY8突变为主)，均属于ABC 亚型。由于一些DLBCL病例具有复杂且独特的特征，在建立LymhGen算法的包括574例DLBCL患者的研究中，只有329例(63.1%)病例可以明确其基因亚型(包括“核心”、“延伸”以及“组合”亚型)。这几种遗传亚型揭示了DLBCL与惰性淋巴瘤的潜在致病关系：BN2亚型类似于边缘性淋巴瘤(MZL)；EZB亚型与滤泡性淋巴瘤(FL)相关；以DUSP2、SGK1和JUNB为主高度重复突变的ST2亚型，与结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)和富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤(THRLBCL)具有很强相似性[28]。值得注意的是，MCD亚型经常会涉及结外器官，如中枢系统、视网膜、睾丸、乳房等部位。学者们为体现“双打击淋巴瘤”基因表达印记特征，根据MYC基因有无重排又将EZB进一步分为EZB(-)MYC(-)和EZB(-)MYC(+)两个亚型。由于ST2、BN2、N1及A53型多在EZB(-)MYC(-)亚型出现，而EZB(-)MYC(+)亚型中的往往表现为伯基特淋巴瘤(BL)[29]，而EZB(-)MYC(-)比EZB(-)MYC(+)有更好的生存率，因此可将EZB(-)MYC(+)亚型视为EZB(-)MYC(-)亚型的某种转化。在该研究中，进一步阐述了不同的亚型对应于不同的潜在治疗靶点。BCR依赖性NF-κB通路活化在BN2、MCD和A53亚型最为常见，故该亚型对以伊布替尼为代表的BTK抑制剂具有高度敏感性[30]；MCD、BN2、ST2、EZB亚型通常与PI3K通路相关，故可以尝试用PI3K抑制剂；而另外一些MCD、BN2、EZB亚型与BCL-2高表达相关，可能在未来可以试用BCL-2抑制剂；EZB型也可以应用EZH2抑制剂治疗。LymhGen算法通过基因突变谱来推断DLBCL亚型，并提示不同患者的发病机制和治疗敏感性，为将来的临床研究提供了可靠的分型基础[31]。

4 复发/难治性DLBCL基因组的克隆演化

由于DLBCL在临床特征、免疫表型、分子遗传等方面的异质性，尽管以R-CHOP为代表的标准一线治疗方案取得很大成功[32]，但仍有部分患者出现复发、进展甚至死亡。为了探索复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤(relapsed and refractory DLBCL，R/R DLBCL)治疗耐药的分子机制并识别候选基因，Lee等[33]学者对58例R/R DLBCL患者的430个淋巴瘤相关基因进行了靶向深度测序，发现最频繁突变(>20%)的基因是CDKN2A、PIM1、CD79B、TP53、MYD88、MYC、BTG2、BTG1、CDKN2B、DTX1、CD58、ETV6和IRF4。与较低的OS率相关的基因突变主要包括NOTCH1、FGFR2、BCL7A、BCL10、SPEN和TP53(P<0.05)。FGFR2、BCL2、BCL6、BCL10和TP53与较短的PFS率相关。为了进一步了解DLBCL的克隆演化规律，该研究还比较了18例患者的R-CHOP治疗前和治疗后复发/难治二次活检的样本，得出3个重要结论：(1)CXCR4、MEF2B和DUSP2突变倾向于化疗后首次在主克隆中出现；(2)NCOR2、GNAS、EBF1、FOXP1、RUNX1、PCLO、CD58、RICTOR、CREBBP等体细胞拷贝数改变在化疗后有增加的趋势；(3)MYD88、CD79B等NF-κB通路激活驱动基因多为突变体[34]，系统性化疗前后变化较小。同时该研究还比较了扩增基因和缺失基因的拷贝数，得出：MCL1、AKT2、CARD11、GNA12、CKS1B、ACTB、TNFRSF11A、HIST1H2BJ、BTG2、CD79A、POU2F2、VHL和HIST1H2BC的拷贝数在复发难治患者有增加趋势。相比而言，B2M、CDKN2B、CDKN2A、TNFAIP3、BCL7A、FYN、TNFRSF14、SGK1、ESR1、CD70、TP53和ECT2L的拷贝数在复发难治患者趋于减少。R/R DLBCL的基因组可以通过参与细胞周期、NF-κB通路、RAS信号、转录调控、DNA损伤、B细胞分化凋亡、PI3K Akt mTOR通路和免疫逃逸等方式致使基因突变路径尤其丰富。一些驱动突变更容易在R/R DLBCL中富集，如CD79B、CDKN2A、MYD88、MYC和CCND3等，提示这些基因突变对DLBCL的预后有负面影响[35-36]。CDKN2A突变是R/R DLBCL最常见的突变，是R-CHOP治疗后不良预后的指标[37]。CDKN2A和TP53突变同时存在，提示患者较低的OS率，且独立于IPI评分[24]。以上结果可能与2014年Jiang等[38]首次提出的克隆演化的两种模式相对应，第1种为“后期发散”模式：复发克隆基因可以通过获得额外的复发驱动突变直接从初诊克隆基因组演化而来。第2种是“早期分歧”模式：初诊和复发克隆的基因突变可以同时从一个早期祖细胞演化而来，但携带有非常不同的体细胞突变模式。R/R DLBCL是DLBCL治疗中一个尚未解决的问题，通过识别突变谱和整合分析克隆演化规律，将为进一步深入理解R/R DLBCL的耐药机制和选择治疗靶点提供了有价值的信息。

5 根据DLBCL分子亚型指导临床治疗的探索

近年来，在DLBCL的治疗探索领域，免疫疗法研究“冲锋在前”，靶向药物之间的联合以及靶向药物与新的小分子抑制剂或化疗药物联合的研究“紧追其后”。随着我们对DLBCL分子分型的认识加深，目前学界已经开始出现根据分子分型调整DLBCL治疗策略的早期尝试。例如在2021年ICML会议上，来自瑞金医院赵维笠教授团队就报道了一项2期临床研究[39]。该研究主要是根据不同基因亚型，在R-CHOP中加入新的靶向药物(R-CHOP+X)，以观察新诊断DLBCL治疗后的预后情况。研究者首先对128例患者FFPE的肿瘤标本进行靶向测序，利用18个基因突变、BCL2易位和BCL6融合，采用简化方法将患者分为MCD、BN2、N1、EZB、TP53和NOS这6个基因亚型。62%的入组患者根据Hans算法归为non-GCB型，36%的入组患者为MYC/BCL2双表达。MCD、BN2、N1、EZB、TP53、NOS分型所占患者比例分别为20%、18%、4%、2%、16%、39%。入组患者分为标准R-CHOP组和R-CHOP+X组。R-CHOP+X组患者在接受标准的R-CHOP治疗基础上，MCD和BN2亚型患者加用BTK抑制剂伊布替尼420 mg/d治疗，N1和NOS亚型患者加用免疫调节剂来那度胺25 mg/d，第1～10天治疗，EZB亚型患者加用组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺20 mg，第1、4、8、11天治疗，TP53亚型患者加用静脉注射去甲基化药物地西他滨10 mg/m2，第1～5天治疗。截止2021年3月1日，所有入组患者完成至少3个周期免疫化疗。研究者对107例可评估疗效患者分析后得出结论：R-CHOP+X组CR率为85%，ORR为91%；R-CHOP组CR率为65%，ORR为72%。中位随访14.1个月，R-CHOP+X组的1年PFS和OS率分别为96%和98%，而R-CHOP组的1年PFS和OS率分别为79%和94% (PFS:HR0.22，95%CI0.09～0.61；OS：HR0.28，95%CI0.05～1.60)。R-CHOP+X组相比R-CHOP组3、4级血液学和非血液学不良事件发生均有所增加，但绝大多数患者可耐受。上述研究表明，根据不同基因亚型加入靶向药物的R-CHOP+X治疗方案，有望在R-CHOP基础上进一步改善患者的近期和远期疗效，这将是未来的治疗方向。

综上所述，随着DLBCL分子分型的进步，我们对不同类型DLBCL的生物学行为和内在发病机制的认识日益深入，从而对不同类型患者的临床病程、治疗反应和预后判断也愈加精确，未来必将持续提高临床治疗手段的个体化程度。在2017年修订版的WHO分型中，已经开始强调各亚型的细胞分子生物学标记的诊断、治疗及判断预后的作用，同时突出了病理和临床紧密联合的影响[40]。未来如何继续深化DLBCL的临床分子分型体系，如何在此基础上深入挖掘和探索新的治疗方案及研发新的靶向治疗药物还需要更长时间系统性的基础和临床研究[41]。相信在此基础上，DLBCL超越R-CHOP时代，进入下一个精准诊疗和个体化的时代，必将很快成为现实。

利益相关声明：本文作者声明不存在任何与本论文相关的利益冲突。

作者贡献说明：张新友：发现问题、提出意见；周继豪：设计框架、构思内容；陈婷婷：文献收集、撰写论文。