精子领形成及精子领内运输相关蛋白的研究进展

王心依，王治琪，王珺，徐琴舟，夏小雨

精子形成是精子发生的重要阶段。在精子形成过程中，圆形的单倍体精子细胞经历了显著的核和细胞骨架修饰，以获得精子特有的、高度极化的形态。这一过程涵盖顶体发育、核固缩和鞭毛组装等。其中，精子领（manchette）是精子形成过程中一个短暂存在的结构，主要由细胞骨架成分微管和肌动蛋白构成，以精子领为平台，进行着活跃的物质运输，在精子核固缩及鞭毛组装过程中发挥重要作用。由于缺乏男性单倍体生精细胞体外培养体系，目前与精子领相关的分子机制研究只能依赖于动物模型。本文综述了近年来有关精子领及精子领内运输（intra-manchette transport，IMT）的关键调控蛋白的研究进展及临床相关性，可为理解部分男性不育的发病机制、开发可能的治疗手段提供理论依据。

1 精子领的形成及结构

精子领是精子形成过程中短暂存在的结构，首先出现于人类第2步（Step2）精子细胞[1]和小鼠Step8精子细胞[2]。顶体生物发生的启动早于精子领的形成，且是后者正常发生的重要前提。目前，精子领微管的起源尚不确定，但据Lehti等[3]的综述，在小鼠和大鼠中应当起源于中心粒区域；在精子领组装过程中，短微管在细胞核周围聚集，通过其正端末端（plus end）连接到含有δ-微管蛋白/角蛋白9的核周环（perinuclear ring），并迅速形成一个含有多达1 000条微管的裙状（skirt-like）结构[4-5]；另一方面，微管之间彼此连接形成网状结构，再通过核骨架与细胞骨架连接（linker of nucleoskeleton and cytoskeleton，LINC）复合体的中介，在多个位点与核膜相结合[6]。随着核周环逐渐收缩，精子领逐渐向形成中的精子尾部迁移。在精子领发育过程中，钩蛋白（HOOK）及其相关复合体参与精子领微管交联、精子领迁移的调控；精子细胞特异性的LINC复合体负责精子领与核膜的连接，调节精子核成形（nuclear shaping）；精子相关抗原蛋白家族（sperm associated antigen，SPAG）、中心体蛋白家族（centrosomal protein，CEP）和纤毛及鞭毛相关蛋白家族（cilia- and flagellaassociated protein，CFAP）也在精子领的组装及维持中发挥作用。已有实验数据证实，上述蛋白的表达异常都可能造成精子形成障碍。

1.1 HOOK1HOOK1是钩蛋白家族成员。小鼠精子细胞通过可变剪切表达Hook1蛋白的变异体，该变异体很可能使精子领微管之间发生交联，从而保证其完整性；而全长Hook1蛋白可能在促进精子领本身的延伸及其向尾部迁移中发挥作用。Hook1基因缺失会引起精子领畸形，导致精子头部或尾部形态异常和断头，进而导致雄性小鼠不育[7]。在人类中也发现了由HOOK1基因突变导致断头精子症的家系[8]。

1.2 钩蛋白相关复合体神经元突触膜结合蛋白3（Rab3 interacting molecule binding protein 3，RIMBP3）在人和小鼠中高度同源，该蛋白在小鼠精子细胞中特异表达。富亮氨酸重复序列和鸟苷酸激酶结构域蛋白（leucine-rich repeats and guanylate kinase domain containing，LRGUK）高表达于小鼠精子形成阶段。在小鼠中，Hook1/2/3可与RIMBP3、LRGUK以及驱动蛋白轻链3（kinesin light chain 3，KLC-3）共同形成蛋白复合体，参与顶体附着、精子领发育及IMT、精子核成形和精子尾部轴丝延伸等多个环节的调控。小鼠中Rimbp3基因的缺失[9]或Lrguk基因的突变均可导致雄性小鼠不育[10-11]。

1.3 Sad1/UNC84结构域（Sad1-UNC84 homology domain，SUN）蛋白家族在人和小鼠等哺乳动物中，LINC复合体的组分主要包括定位于核内膜SUN蛋白家族及定位于核外膜的Nesprin蛋白家族。在小鼠精子发生中，精子领通过LINC复合体与核膜连接，这对精子领的迁移及精子的最终形态至关重要。SUN蛋白家族成员SUN3和SUN4是小鼠睾丸特异性核膜蛋白，二者存在直接结合；由SUN3/SUN4参与形成的LINC复合体负责将精子领连接到核膜[12]。在Sun4敲除小鼠的精子细胞中，精子领从核周环上解离，最终长形精子无法形成，雄性小鼠不育，其表型与人类圆头精子症（globozoospermia）类似。Sun3敲除雄性小鼠的表型与之相似且更加严重，表现为精子领缺失、核固缩异常、顶体和鞭毛结构紊乱、精子数量显著下降[6]。

1.4 SPAG17小鼠的SPAG诸多成员参与单倍体精子细胞形变过程的调控。其中，SPAG17蛋白与精子领微管结构共定位；而在成熟精子中，SPAG17蛋白信号出现在顶体和尾部。敲除小鼠的Spag17基因会引起精子领结构异常、头部形态缺陷和IMT障碍，最终导致雄性小鼠不育[13]。

1.5 CEPCEP70和CEP131参与调控纤毛的形成、中心粒的复制及基因组的稳定性。在小鼠中敲除这2种基因后均可导致雄鼠不育，但表型存在差异。Cep70基因缺失小鼠精子顶体和鞭毛形成出现异常，但仍有精子形成[14]；而Cep131基因缺失会导致精子发生停滞于Step9的单倍体精子细胞，主要是由于精子领结构不能正确组装，导致IMT障碍[15]。

1.6 CFAPCFAP43和CFAP44均在睾丸中特异性高表达。2017年以来的多篇文章证实，人类CFAP43及CFAP44基因的突变与精子鞭毛多种形态异常（multiple morphological abnormalities of the flagella，MMAF）有关[16]。Cfap43或Cfap44敲除小鼠均出现MMAF表型。Cfap43敲除小鼠的精子细胞还可以观察到形态异常的精子领，提示CFAP43不仅参与调控鞭毛组分运输和组装，还参与正常精子领结构的维持[17]。这一家族的另一成员CFAP65蛋白定位于人类精子顶体区域和鞭毛中部，人类CFAP65基因突变可导致顶体发育不全、鞭毛畸形，最终表现为严重的弱精子症。Cfap65敲除雄鼠同样表现为严重的弱精子症，其精子细胞的部分细胞骨架相关蛋白表达量下调，精子领发育及IMT出现障碍，精子形成过程受阻[18]。

1.7 CAP-Gly结构域连接蛋白1（CAP-Gly domain containing linker protein 1，CLIP1）CLIP1是一种微管正端追踪（plus-end-tracking）蛋白，参与微管动力学的调控、动力蛋白激活蛋白（dynactin）的定位以及内体与微管之间的连接。在小鼠睾丸中，CLIP1蛋白高表达于精原细胞与早期精母细胞，并出现在精子形成阶段的中心体和精子领上。Clip1基因敲除雄鼠精子头部异常、生育力低下[19]。

1.8 前纤维蛋白3（profilin 3，PFN3）PFN是细胞内肌动蛋白聚合的关键调节因子，包括PFN1～PFN4。在小鼠精子细胞中，PFN3特异性定位于高尔基体、顶体前体小泡、顶质体-精子领复合体和线粒体。在Pfn3基因敲除小鼠中，包括丝切蛋白1/2（cofilin1/2）、肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor）在内的重要的细胞骨架调节蛋白表达上调，进而出现精子领发育异常、顶体及鞭毛畸形，最终产生圆头精子症表型，雄性生育力下降[20]。

1.9 SEPT14-ACTN4蛋白复合体隔蛋白（septin）是高度保守的三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）结合蛋白，聚合的隔蛋白通过与微管、肌动蛋白和其他细胞成分的相互作用，参与细胞骨架的调控。在小鼠中，隔蛋白SEPT14与辅肌动蛋白ACTN4（alpha-Actinin-4）共同定位在早期延长型精子细胞中的精子领及核周区域，参与精子领结构的维持。携带SEPT14突变的男性精子样本中，ACTN4的定位及分布异常，并伴有精子头部畸形[21]。

1.10 轴丝动力蛋白轻链结构域蛋白1（axonemal dynein light chain domain containing 1，AXDND1）AXDND1在人与小鼠中高度同源，仅在睾丸中单倍体精子细胞中特异性高表达，并与微管蛋白结合。测序结果证实，人类AXDND1基因突变与男性非梗阻性无精子症有关。Axdnd1敲除的雄鼠虽然可以形成精子领，但其结构和动态变化异常，最终导致晚期精子细胞大量凋亡、雄鼠不育[22]。

2 IMT及其调控

小鼠的精子领存在于Step8～Step14精子细胞。在此期间，各种货物蛋白（cargo protein）依赖IMT到达特定位点，这对核固缩及精子尾部鞭毛的组装都十分重要。值得注意的是，精子领内微管的正端末端指向顶体，与尾部鞭毛中微管的极性相反[3]。因此，向顶体方向进行的IMT需要顺向马达蛋白，如驱动蛋白（kinesin）；而向远离顶体的方向运输需要逆向马达蛋白，如动力蛋白（dynein）；此外，F-肌动蛋白（F-actin）和肌球蛋白（myosin）也在精子领上有定位[23-25]。除上述细胞骨架相关蛋白外，钩蛋白家族、鞭毛内运输蛋白（intraflagellar transport，IFT）家族等也在IMT中发挥作用，各蛋白家族成员往往彼此结合组成特定的蛋白复合体。

2.1 驱动蛋白家族（kinesin family）驱动蛋白家族成员KIF3A、KIF3B、KIF17b、KIF27、KIF5CA[1,3,23]等在精子领上均有定位，推测其参与IMT过程。其中，KIF3B可与HOOK1-RIMBP3形成复合体[9]。KIF3A可与KIF3B或KIF1结合蛋白（KIF1-binding protein，KBP）相互结合，并负责减数分裂特异性核结构蛋白1（meiosis specific nuclear structural 1，MNS1）的IMT[26]。在小鼠生精细胞中条件性敲除Kif3a会导致精子领功能异常，进而导致精子头部畸形[27]。

2.2 IFT复合体-B在精子形成过程中，鞭毛组装早于精子领的形成，由基粒微管延伸形成轴丝。以轴丝为基础的鞭毛内运输主要由IFT复合体负责[28]。其中，IFT复合体-A含有6个亚基，负责逆向运输（负端定向运输）；IFT复合体-B含有16个亚基，负责顺向运输（正端定向运输）。研究发现，除了定位于发育中的鞭毛，IFT复合体-B还定位于精子领。敲除小鼠的编码IFT-B亚基的基因，包括Ift20、Ift25、Ift27、Ift74和Ift88等，可导致雄鼠不育[28-31]，这也体现出IMT与IFT的共性。

2.3 丝氨酸/苏氨酸激酶36（serine/threonine kinase 36，STK36）在小鼠睾丸中，STK36蛋白定位于精子领和顶体-顶质体复合体，并与KIF27蛋白以及鞭毛中外周致密纤维蛋白（outer dense fiber 1，ODF1）形成蛋白复合体。在雄鼠生殖细胞中条件性敲除Stk36基因会导致精子数量减少、头部畸形、断头和精子运动缺陷，进而导致不育[32]。

2.4 Parkin共调基因（Parkin co-regulated gene，PACRG）-减数分裂表达基因1（meiosis-expressed gene 1，MEIG1）蛋白复合体在小鼠精子形成过程中，PACRG蛋白可以招募MEIG1蛋白到精子领，两者的结合可以稳定PACRG蛋白使其免于降解。PACRG-MEIG1蛋白复合体负责部分货物蛋白（如精子鞭毛蛋白SPAG16L）在精子领内的运输。当小鼠MEIG1 蛋 白Y68 氨 基 酸 突 变 时，MEIG1 无 法 与PACRG结合，IMT功能出现异常[33]。Meig1突变或缺失的雄鼠表现出精子细胞核固缩及鞭毛发生障碍，雄性不育。PACRG-MEIG1蛋白复合体在小鼠与人类之间高度保守，人类PACRG基因启动子的突变是与男性无精子症相关的危险因素[34]。

2.5 精子鞭毛蛋白2（sperm flagellar 2，SPEF2）在小鼠睾丸中，SPEF2可作为动力蛋白1的接头蛋白（linker protein），将IFT20连接到精子领结构上，而IFT20蛋白又与HOOK及其他IMT功能蛋白相互结合。在雄性小鼠生殖细胞中条件性敲除Spef2基因会导致IMT障碍，致使小鼠精子头部和尾部畸形、精子数量下降[35]。

2.6 末端核苷酸转移酶5C（terminal nucleotidyltransferase 5C，TENT5C）TENT5C属于高度保守的非经典RNA多腺苷聚合酶（non-canonical RNApolyadenylation polymerase）家族，在人和小鼠的睾丸中大量表达，并精确定位于精子领。TENT5C基因敲除雄性小鼠不育，虽然其精子形成过程中精子领结构是正常的，但产生大量无头精子；也可产生少量形态无异常的精子，但卵细胞质内精子注射实验显示，它们的受精能力受到了严重损害[36]。

3 精子领的消除

小鼠精子领的消除发生在精子形成的Step13～Step14，精子领以类似拉链状的运动方式向精子尾部移动，与此同时，核周环收缩，帮助精子头部延伸及固缩[3]。随后，由微管切割蛋白Katanin主导了精子领的消除。Katanin定位于精子领微管的负端（minus end），也就是伸向尾部的一端。Katanin由催化亚基p60和调节亚基p80构成，突变的p80蛋白将导致精子领消除的延迟及精子尾部结构的畸形[37]。在此过程中，WD40 重 复 蛋 白62 （WD40 repeat protein 62，WDR62）参与招募Katanin到精子领，因此，Wdr62基因突变小鼠的精子领消除出现障碍，进而导致少弱畸形精子症表型[38]。KATNAL2（Katanin-like 2）蛋白也是微管切割蛋白Katanin家族的成员，Katnal2突变或条件性敲除的雄性小鼠精子领结构异常，并最终导致不育[39]。

4 结语

精子变形过程机制复杂，精子领及IMT在其中发挥重要作用。干扰精子领的组装、维持、消除以及IMT的正常调控，都可能导致不同程度的生精障碍。除正文中所列因子外，还有一些蛋白也被发现定位于小鼠或人类精子领上[40-47]，若功能缺失则会导致生精障碍，但具体机制仍有待研究。随着基因敲除等生物学技术的发展，将有越来越多的精子领功能相关蛋白被验证。这也将为临床上因精子形成障碍所引起的男性不育的诊治以及未来男性新避孕靶点的研发提供重要的理论参考。