HPV16相关宫颈癌中PI3K/Akt自噬通路与HIF-1α的关系

吴桐桐，王志莲

宫颈癌是全球第四大常见的恶性肿瘤，也是全球女性因恶性肿瘤死亡的第四大原因[1]。据统计，全球每年宫颈癌新发病例中近1/3发生在中国，我国宫颈癌每年发病率高达7.5/10万，死亡率为3.4/10万[2]。据流行病学统计，我国宫颈癌的发病和死亡高峰年龄均呈年轻化趋势，因此，在中国宫颈癌仍是重要的公共卫生问题。尽管人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗、宫颈癌癌前筛查、阴道镜检查、手术切除以及放化疗显著降低了宫颈癌病死率，但其5年生存率仍较低[3-4]，因此找出宫颈癌进展中的关键事件和调节分子可能是实现宫颈癌精准防治的关键。

持续的高危型人乳头瘤病毒（high risk human papilloma virus，HR-HPV）感染是宫颈癌发生发展的高危因素，由于肿瘤的发生发展一般是多种生物因素共同作用的结果，单独的HPV感染不足以导致肿瘤的发生发展，因此进一步探究宫颈癌发生发展的潜在细胞分子机制仍然是妇科肿瘤的研究热点。自噬在介导病毒感染及肿瘤发生中也起着关键作用，有研究发现自噬和HPV之间相互作用密切，自噬紊乱可能有利于HPV感染及致瘤；HPV还利用细胞自噬促进受感染的宫颈上皮细胞增殖，显著促进宫颈癌变发生[5]。缺氧是绝大多数恶性实体肿瘤的生存微环境，宫颈鳞状细胞癌是宫颈癌最常见的病理类型，属于实体肿瘤，缺氧是其主要的物理特征之一，而许多缺氧调控的基因受缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）控制，HIF-1普遍存在于实体瘤中，只有在缺氧条件下才能稳定表达，其可以调控糖代谢、血管生成和氧气运输等过程中一些蛋白质的形成[6]。目前自噬和缺氧在宫颈癌发生发展过程中的研究尚处于起步阶段，现综述宫颈癌中自噬的发生与缺氧的关系，以期为寻找治疗HR-HPV相关宫颈癌的新靶点提供理论依据。

1 HPV、HIF-1α、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）自噬通路与宫颈癌

1.1 HPV16与宫颈癌HR-HPV持续感染是宫颈癌的主要原因[7]。HR-HPV感染能够显著促进宫颈柱状上皮细胞的病变并增加宫颈癌的发生风险，尤其当患者有HPV16感染时，高级别宫颈上皮内瘤变或宫颈癌的发生风险可进一步上升[8]。HR-HPV包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73型，其中16、18型易侵犯鳞柱交界区。HPV16改变了细胞中与凋亡、黏附、转移、血管生成和代谢相关的各种基因的表达[9]。HPV16 E6和E7癌蛋白对驱动宫颈癌发生起关键作用。在复制病毒基因组的过程中，E6和E7可以诱导癌细胞的所有特征，即不受控制的细胞增殖、血管生成、侵袭、转移和不受限制的端粒酶活性，以及逃避凋亡和生长抑制因子的活性。一些体外和异种移植研究还表明，在没有E6和E7活性的情况下，癌细胞会衰老或发生凋亡，因此HPV16可通过E6、E7促进癌细胞增殖[10]。此外，HPV16 E6、E7癌蛋白通过与调节细胞代谢的分子[如p53、视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）、c-Myc和HIF-1α]的相互作用而有利于瓦博格效应（Warburg effect）[11]。

1.2 HIF-1α与宫颈癌越来越多的研究表明，低氧是肿瘤微环境的重要标志，肿瘤细胞的快速生成常需要消耗大量的ATP，造成局部缺氧。肿瘤低氧微环境能促进肿瘤远处转移，促进肿瘤新生血管生成，减少细胞凋亡，影响细胞周期。HIF-1由α和β两个亚单位组成（HIF-1α和HIF-1β），HIF-1β亚基在细胞质中稳定表达，HIF-1α是一种氧分压感受器，同时也是主要的缺氧应激转录因子。常氧状态下HIF-1α易受泛素蛋白酶体系的降解，而缺氧时HIF-1α降解受抑制，导致其不断积累，使癌细胞不断适应低氧微环境，为癌细胞的增殖、侵袭和转移等过程提供条件[12]。因此，正常氧饱和度下的细胞中基本检测不到HIF-1α亚基，而在缺氧状态下，HIF-1α亚基的降解被抑制，α和β亚基形成有活性的HIF-1，转移到细胞核内调节多种蛋白的表达，如转铁蛋白（transferrin，TF）、己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）、含Jumonji结构域（JMD1A）、钙黏蛋白（cadherin，CDH）、葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）、重组人果糖二磷酸醛缩酶C （fructose-bisphosphate aldolase C，ALDO-C）、乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase-A，LDH-A）、丙酮酸激酶M2型（pyruvate kinase-M2，PKM2）、碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase-Ⅸ，CAⅨ）和果糖-2,6-二磷酸酶4（PFKFB 4），这些蛋白介导肿瘤微环境的形成及癌症的发生发展，如遗传不稳定性、葡萄糖代谢、pH值的调节及肿瘤血管生成、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[11]。与HR-HPV相关的不同类型的癌症中也能观察到这些蛋白，包括HPV16相关宫颈癌[13]。在宫颈癌患者中，HIF-1α高表达不仅是缺氧的内在生物学标志，而且是肿瘤侵袭性、恶性进展和预后的独立指标[14]。有研究表明，HIF-1α的过度表达会使接受宫颈癌根治性放疗的患者对放疗的反应性减弱，预后不良。虽然针对HIF-1α的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）已广泛应用于肿瘤的治疗，以克服缺氧相关耐药，但其临床效果仍需进一步研究和验证，尤其是在宫颈癌中[15]。

1.3 PI3K/Akt自噬通路与宫颈癌目前宫颈癌发生发展的分子机制尚未完全阐明。自噬普遍存在于大部分真核细胞中，维持体内代谢平衡，促进细胞在应激反应中存活。近年研究发现，自噬失调与宫颈癌的发生、发展和治疗有关[16]。PI3K/Akt通路是一条经典的自噬通路，PI3K是细胞中的脂质激酶家族，可被多种细胞因子激活，如表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF） 和受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK），并转化为磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol，PIP3）。PIP3作为第二信使与Akt的PH域结合，Akt蛋白结构的改变导致Akt在细胞膜上聚集，激活的PI3K-Akt复合物进一步激活其下游分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），从而抑制自噬[17]。有研究发现，宫颈癌患者的组织提取液中PI3K/Akt/mTOR蛋白水平明显高于健康人和宫颈上皮内瘤变患者，且宫颈癌患者的组织提取液中PI3K/Akt/mTOR的基因和蛋白表达水平随肿瘤恶性程度的增加而升高。一些微小RNA（microRNA，miRNA），如miR-338和miR-149，可以通过这一信号通路调控宫颈癌的发生发展[18]。另有研究表明，PI3K信号的长时间激活使宫颈癌患者对化疗耐药，预后不良[19]。因此，PI3K/Akt信号通路可能是宫颈癌潜在的治疗靶点。

2 HPV16、HIF-1α和PI3K/Akt自噬通路在宫颈癌中的相互关系

2.1 HPV16感染增强了宫颈癌中HIF-1α的表达宫颈癌细胞中HPV16与HIF-1α是相互作用的，共同促进宫颈癌的进展。一方面，宫颈癌细胞的低氧微环境能强烈下调HPV16 E6和E7癌蛋白的表达，使其进入可逆性增殖停滞期，这种休眠状态有助于HPV16阳性宫颈癌细胞的免疫逃逸和治疗抵抗。另一方面，HPV16感染宫颈上皮细胞后，能增强HIF-1α的表达[20]。HPV16 E6和E7癌蛋白通过多种途径调节HIF-1α。p53通过双微体基因2（bimicrosomal gene 2）介导HIF-1α的泛素化降解，而E6癌蛋白可通过促进p53的泛素化降解来提高HIF-1α的水平，进一步激活其下游的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促进宫颈癌的血管生成[21]。另有研究发现，宫颈癌低氧微环境下，E6癌蛋白通过作用于HIF-1α和细胞周期调节因子的上游效应器——丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）/细胞外信号调控蛋白激酶1/2（ERK1/2）增强HIF-1α蛋白的活性，形成一种具有更强迁移潜能的耐缺氧表型[22]。E6癌蛋白还可以阻碍HIF-1α与抗肿瘤血管三结构域单链抗体（VH/L）结合，导致HIF-1α积累，从而促进宫颈癌细胞的Warburg效应[23]。HPV16 E6和E7癌蛋白还可以通过抑制Ras家族糖尿病相关基因（RRAD）的表达上调磷酸化K基因结合核因子（pSer536）在细胞核中的表达水平，进一步上调HIF-1α的表达[24]。也有证据表明，E6和E7可通过HIF-1α/VEGF途径提高VEGF和其他血管生成因子（如白细胞介素8）的表达，促进宫颈癌中的血管生成。因此推测，调节感染HPV16患者的HIF-1α表达或许能延缓宫颈癌的进展[25]。

2.2 HPV16通过PI3K/Akt通路抑制细胞自噬目前研究显示，自噬受抑制可促进HPV生命周期和肿瘤进展[5]。HPV是一种双链DNA病毒，具有环状基因组，编码复制、转录和转化必需的早期基因E1、E2、E4、E5、E6和E7，以及编码病毒衣壳蛋白的晚期基因L1和L2。HPV16颗粒与基底层角质形成细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPG）结合触发L2衣壳蛋白的构象变化，导致L2氨基末端一个裂解位点暴露，其蛋白水解促进了病毒衣壳与角质形成细胞膜上的次级受体的进一步相互作用。在这种结合之后，HPV16通常被内吞作用内化。而HPV16颗粒的结合和内化都是与宿主自噬密切相关的过程。HPV16感染宫颈上皮细胞与激活mTOR通路抑制自噬有关。尤其是与HPSG结合时，HPV16与存在于靶细胞质膜上的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）相互作用，使Akt磷酸化，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN）失活，最终导致mTOR磷酸化和激活。一旦激活，mTOR可促进mTOR复合物1（mTOR complex 1，MTORC1）、底物4E-BP1[elongation initiation factor (EIF)-4E binding protein 1，4E-BP1]和核糖体蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）的磷酸化和激活，同时其去磷酸化UNC-51样自噬激活激酶1（UNC-51-like kinase 1，ULK1），从而抑制自噬。可见，HPV16通过PI3K/Akt/mTOR通路减少宿主的自噬反应，利用其结合和内化促进的分子事件保护进入的病毒粒子免受快速降解，从而延长HPV16在受感染细胞内的寿命[26]。因此，需要更多的研究来阐明自噬与病毒感染和肿瘤发展的关系，彻底了解这些分子机制对开发新的抗病毒药物和靶向治癌疗法至关重要。

2.3 HIF-1α介导的促肿瘤生长作用可能受其上游PI3K/Akt自噬通路调节肿瘤细胞中的自噬对防止能量危机和维持饥饿期间的核苷酸储备是必要的，通过三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环维持能量稳态和核苷酸水平[27]。HIF-1α是由低氧诱导表达的一个重要的调节肿瘤生长、代谢的转录因子，其除了通过泛素-蛋白酶体途径降解，还可以通过细胞自噬途径降解。已证实在一些肿瘤中，HIF-1α通过PI3K/Akt信号通路促进肿瘤生长。PI3K/Akt信号通路通过激活mTOR下游效应分子p70S6K1调控VEGF和HIF-1α的表达，促进肝癌的血管生成；B7-H3通过PI3K/Akt/mTOR途径上调HIF-1α，促进口腔鳞癌中的糖酵解[28]；盐诱导激酶2（salt-induced kinase 2，SIK2）通过激活PI3K/Akt信号通路上调HIF-1α的表达，直接上调主要糖酵解基因的转录，进而促进卵巢癌的发展[29]。Akt还通过激活下游mTOR基因表达诱导Warburg效应，导致HIF-1α的积累[30]。有研究发现，宫颈癌中的核因子90通过PI3K/Akt信号通路调节HIF-1α/VEGF的表达，促进宫颈癌血管生成[31]。因此，探讨宫颈癌中PI3K/Akt信号通路及HIF-1α的表达意义，有助于为治疗宫颈癌的新靶点提供理论依据。

3 HPV16通过PI3K/Akt信号通路增强HIF-1α的表达，促进宫颈癌的进展

HPV16阳性宫颈癌细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路、HPV16 E6/E7癌蛋白之间存在复杂的相互作用，这些都依赖于细胞的代谢和氧合状态[4]。细胞内的缺氧环境使HIF-1α蛋白稳定表达，激活下游的DNA损伤反应调节基因1（REDD1），抑制mTORC1，使HPV16阳性宫颈癌细胞逃避mTORC1信号引起的衰老。有研究表明缺氧条件下，HPV16的AA亚系变异体和E6癌蛋白的E-G350变异体可激活PI3K/Akt通路，抑制自噬，正向调节GLUT1、GLUT4的表达和葡萄糖摄取来获得营养[32]。E6癌蛋白中存在E-A126（R8Q）、E-G131（R10G）、E-G350（L83V）和E-T245（R48W）突变的HPV16变异体，它们激活Wnt信号通路，Wnt/β连环蛋白途径调节RTK的激活，从而激活PI3K/Akt通路抑制自噬，导致HIF-1α蛋白的积累，引发Warburg效应，使细胞质内丙酮酸增加，进入TCA循环并转化为能量[33]。由此可见，在缺氧条件下HPV16通过介导PI3K/Akt途径获得营养[34]。在HPV16相关宫颈癌中，HPV16 E6和E7癌蛋白通过PI3K/Akt信号通路抑制细胞自噬，导致HIF-1α积累，从而诱导VEGF表达、巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibition factor，MIF）分泌和几种糖酵解酶的表达，如PKM2、LDH 和单羧酸转运蛋白4（monocarboxylate transporters 4，MCT4）[35]。而作为免疫系统抑制因子的MIF分泌的增加，以及通过Warburg效应产生的乳酸，可能导致亲肿瘤微环境的发生。VEGF的表达与低度宫颈上皮内瘤变和宫颈早期浸润癌有关[14]。由此推测，HPV16可以诱导宫颈癌细胞中HIF-1α蛋白的积累，促进宫颈癌进展，这可能是通过PI3K/Akt自噬通路实现的。

4 结语与展望

在HPV16相关宫颈癌中，HPV16可以通过PI3K/Akt通路抑制自噬，诱导HIF-1α蛋白积聚，进而诱导MIF分泌、几种糖酵解酶及VEGF的表达，促进宫颈癌的进展，提示HIF-1α及其上游PI3K/Akt信号通路可作为治疗HPV16相关宫颈癌的潜在靶点。然而自噬与宫颈癌的发生发展关系非常复杂，PI3K/Akt信号通路在宫颈癌中调节自噬的作用取决于肿瘤阶段、组织类型以及致癌基因突变等众多因素，因此深入研究自噬在宫颈癌发生发展中的具体作用机制有很高的研究价值。相信在不久的将来，以自噬为靶点的分子生物治疗的研究可以获得突破，为宫颈癌的靶向治疗提供一个新的靶点。