美拉德反应修饰的酪蛋白递送生物活性物质的应用研究进展

张晶晶，李艾黎，程金菊

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

近年来，随着人们生活水平的提高和食品科学的发展，将食物中天然存在的生物活性物质添加到食品中开发功能性食品进而促进人们身心健康已成为食品领域的研究热点。然而，生物活性物质在食品加工和贮藏过程中易受诸多环境因素（高温、强酸强碱、离子强度光照以及氧气等）的影响、其低水溶性或与食品体系中其他食品成分的不相容性以及在胃肠环境中的不稳定性等均可导致生物活性物质的破坏和降解，极大降低了其生物利用率，限制其在食品工业化生产中的应用[1]。为解决这一问题，科研人员利用一些递送体系对其进行保护，以期提高其稳定性和生物利用率。这些递送体系包括乳状液、复合凝聚物和纳米递送载体等。

美拉德反应作为一种绿色的蛋白改性方法，其制备的蛋白质-多糖共价复合物具有较好的溶解性和较高的稳定性，这使得它们在食品和医药工业中作为生物活性物质的递送载体具有很好的应用前景。酪蛋白是被广泛使用、价格低廉、天然存在和一般认为安全的原料，具有很高的营养价值和良好的感官品质。同时，酪蛋白中有大量的脯氨酸，阻碍了酪蛋白折叠成团，使其结构呈开放式状态，是改性研究的良好基材[2]。利用美拉德反应生成的酪蛋白-多糖共聚物的功能特性（如环境稳定性、乳化性、溶解性等）相比天然酪蛋白明显改善，且其作为营养素的递送载体在其包埋、增溶、靶向释放等方面表现出良好的特性，因而逐渐受到研究者的重视[3]。

本文主要概述了酪蛋白的结构与性质、美拉德反应修饰酪蛋白的制备方法以及其在生物活性物质递送体系中的应用，探究递送体系在胃肠模拟消化系统中的靶向释放，对美拉德反应修饰的酪蛋白在递送生物活性物质方面的合理利用具有指导意义。

1 酪蛋白的结构与性质

1.1 酪蛋白的组成与结构

酪蛋白是指牛乳在20 ℃、pH值为4.6时沉淀的蛋白质，呈酸性，是一种含磷蛋白质，约占乳蛋白质量分数的80%。根据对游离态钙离子的敏感程度，酪蛋白分为4 类，包括αs1-（38%（相对含量，下同））、αs2-（10%）、β-（34%）和κ-酪蛋白（15%），4种蛋白通过疏水和静电相互作用共同构成酪蛋白。酪蛋白具有核壳模型，αs1-、αs2-、β-酪蛋白的多肽链被磷酸钙的微簇结构部分连接，形成酪蛋白的“核”结构；“壳”结构是由κ-酪蛋白在一个外部较低密度片段区域上的“毛发层”结构所形成，提供静电相互作用和空间位阻。这种“核壳”结构共同维持着酪蛋白的各种理化性能。

1.2 酪蛋白的基本性质

作为乳中的主要蛋白质，酪蛋白是由高含量的疏水性或亲水性氨基酸残基片段组成的嵌段共聚物，在乳中以胶束形式存在。酪蛋白胶束是天然的纳米递送系统，其内部包含大量的水（平均每克蛋白结合3～4 g水）[4]，这样的多孔结构为其引入特定的非酪蛋白分子提供了可行性。因此，目前有研究采用酪蛋白胶束对生物活性物质进行包埋递送[5-6]。

但天然酪蛋白作为营养素载体在应用过程中存在溶解度低、pH耐受范围窄以及胶束再聚集等问题。此外，酪蛋白富含脯氨酸，其结构中的富脯氨酸多肽不利于α-螺旋和β-折叠的形成，并且无二硫键，因此，酪蛋白没有太多规则的二级或三级结构，被称为流变性的或者无定形态的结构，这种开放式的结构使得它们易被胃蛋白酶水解，引起被包埋活性物质在强酸性环境中被破坏或降解，而不能达到在小肠中靶向释放的目的。如何通过对酪蛋白进行修饰，提高递送体系的环境适应性及其在胃中的稳定性，增强活性物质的肠道吸收是研究的核心问题。通过美拉德反应对酪蛋白进行共价修饰，改善其功能性质并应用于生物活性物质的包埋递送是目前的研究热点之一。

2 美拉德反应修饰酪蛋白的制备方法

美拉德反应又称羰氨反应，是涉及氨基酸、蛋白质或任何含氮化合物的氨基与还原糖的羰基、醛或酮之间的缩合反应。国内外对蛋白质和糖进行美拉德接枝反应的基础方法主要有两种：干热法和湿热法。近年来，也有研究者在传统方法的基础上结合辅助手段进行方法改进，如超声波处理、微波处理、脉冲电场技术等，这些改进方法都已被成功地应用到美拉德反应产物的制备中。

2.1 传统制备方法

2.1.1 干热法

干热法是最先使用的美拉德修饰蛋白质的方法，多用于蛋白质和多糖的接枝反应。1990年，Kato教授首次采用干热法制备了卵清蛋白-葡聚糖接枝物，其乳化性在pH值为3和10时得到了极大改善，可作为大分子乳化剂应用于食品工业中[7]。随后，用干热法对蛋白质进行美拉德反应的修饰受到越来越多人的关注，并在医药[8]、材料[9]、化妆品[10]等领域得到了广泛应用。

干热法非常适合于蛋白质与多糖之间的美拉德反应，一方面是因为蛋白质在水溶液中受到多种分子间作用力及疏水相互作用的影响，许多反应基团被包埋在蛋白质的结构内部；另一方面，多糖立体效应较强，其化学反应具有较强的取向性[11]。此外，干法美拉德改性技术生产成本低、加工技术简单且反应条件温和，使得美拉德反应在食品修饰过程中更容易控制。然而，基于目前的报道，干热法制备美拉德反应产物时间普遍较长，通常为几天到几周。例如Spotti等[12]通过干热法制备乳清蛋白-葡聚糖美拉德产物时，反应时间为5 d；Wang Yongquan等[13]在80 ℃、相对湿度为79%的条件下反应9 d制备了脱酰胺小麦面筋蛋白-麦芽糊精接枝物。而酪蛋白不需要通过变性暴露其活性氨基基团，从而极大缩短了达到理想反应程度的时间。Corzo-Martínez等[14]在水分活度0.67、50 ℃条件下反应4 h制备了酪蛋白美拉德反应产物，且显著增强了酪蛋白的发泡性，但酪蛋白本身溶解性较差，使其在工业上的应用受到了极大的限制，通过干热法对酪蛋白进行美拉德反应修饰极大提高了其溶解性，其他功能性质也在一定程度上有所改善。

Fechner等[15]利用干法反应，在相对湿度79%、60 ℃条件下制备的酪蛋白酸钠-麦芽糊精美拉德反应产物可以稳定水包油型乳状液，使乳状液的粒径更小和更均一，且其在酸性条件下能够降低VB12的释放，是一种较稳定的乳化剂。Corzo-Martínez等[16]发现酪蛋白与半乳糖、乳糖和葡聚糖反应时，黏度随反应时间的延长而增加，并且与半乳糖在50 ℃反应48 h时黏度达到最高。张雅婷[17]研究了酪蛋白和葡聚糖在相对湿度78%、60 ℃下制备的美拉德产物，葡聚糖提供的空间位阻效应使其在pH 2～7范围内均可保持结构的相对稳定，并且明显改善了酪蛋白等电点处的乳化活性。高威[18]在研究酪蛋白与葡萄糖和麦芽糖接枝物的凝胶性时发现，经美拉德修饰的酪蛋白凝胶强度是未修饰酪蛋白的1.43 倍。此外，酪蛋白经修饰后，其溶解性、乳化活性、乳化稳定性、持水性和黏度都有不同程度的提高[18]。

虽然干热法制得的酪蛋白-多糖复合物的溶解性、乳化性、稳定性等均得到了一定程度的提高，但酪蛋白-多糖复合反应的速度极慢，且蛋白质与多糖的空间结构对共价反应的影响很大。另外，反应条件的控制也很严格且容易生成不溶性的大分子。因此，干热法在实际应用过程中受到了极大的限制。

2.1.2 湿热法

湿热法一般用于蛋白质与单糖或双糖的接枝反应，耗时较短，一般为几到十几个小时，当反应温度≤90 ℃时反应速率缓慢，≥100 ℃时反应速率较快。Brands等[19]将酪蛋白和二糖（乳糖、乳果糖、麦芽糖或麦芽酮糖）在pH 6.8、120 ℃油浴下反应60 min，建立了酪蛋白-二糖美拉德反应的动力学模型，并使用多响应建模进行了广泛的测试。王海霞[20]在反应温度为100 ℃、pH值为9.0的条件下仅需3 h即制备了牦牛乳酪蛋白-葡萄糖接枝物，研究发现，美拉德修饰在一定程度上改善了牦牛乳酪蛋白的乳化活性和乳化稳定性、发泡性和泡沫稳定性、吸油性以及抗氧化活性。

虽然湿热法较干热法在反应速度上有所提高，但从目前的报道看，湿热法主要集中在结构简单的蛋白质和小分子糖之间的反应。近年来，Meng Jun等[21]分别通过干热法和湿热法制备酪蛋白-葡聚糖纳米颗粒，研究其理化性质以及对姜黄素的封装能力；原子力显微镜观察发现，与湿热法相比，干热法制备的纳米颗粒粒径更小且分布更均匀，并且有更好的热稳定性、胃肠道稳定性和贮藏稳定性。由此可见，湿热法制备的酪蛋白美拉德反应产物也存在一定的缺陷性和局限性。因此，国内外学者致力于通过新兴加工技术弥补传统方法中的不足，以期寻找有效促进酪蛋白-糖美拉德反应的方法。

2.2 新兴加工技术

2.2.1 超声波技术

超声波是指频率高于20 kHz的声波，分为低强度超声波（0.1～1 MHz、≤1 W/cm2）和高强度超声波（≤0.1 MHz、10～1 000 W/cm2）两类。其中高强度超声技术在食品工业中研究广泛，其特有的空穴作用可以引起机械、物理、化学和生化作用，从而改变食品的理化性质。目前，国内外关于超声波技术的应用主要集中在超声降解、蛋白改性、催化反应以及化学聚合等方面，而在蛋白质-多糖的美拉德反应修饰中的应用报道却较为少见。科学家们研究发现，超声波在媒介中传播时，会产生交替循环的波型运动（压缩波和稀疏波），在循环过程中，由于压力变化会形成空穴气泡且气泡会随着循环过程不断变大，达到临界大小，最终剧烈崩溃。而气泡破裂时会释放巨大能量到周围环境中，这为诱发美拉德反应提供了条件[22]。

近年来研究发现，超声对蛋白质糖基化程度的改善效果显著，与传统的加热相比，超声辅助美拉德反应可提高接枝反应效率以及接枝产物的溶解性、乳化性和表面疏水性[23]。由于活性氨基酸位点通常隐藏在蛋白质内部，从而导致蛋白质-多糖之间的共价作用较弱。而高强度超声波产生的能量可以加速蛋白质结构展开和肽键断裂，并使一些疏水性基团暴露在蛋白质表面，从而增加了蛋白质和多糖之间反应基团的碰撞，提高接枝度[24]。夏琪娜[25]在研究超声预处理结合美拉德反应对酪蛋白反应进程的影响中发现，超声预处理后的酪蛋白-葡萄糖接枝物的接枝度、中间产物含量、褐变程度以及抗氧化性均显著高于未超声处理组。此外，超声组酪蛋白的紫外吸收程度加强，说明其分子内部的疏水性基团逐渐暴露，内源荧光光谱表明蛋白分子结构变得松散，圆二色光谱表明超声组酪蛋白的二级结构变得无序，蛋白分子趋于舒展。葛伟[26]研究发现，与未经超声处理的酪蛋白-葡萄糖接枝物相比，超声预处理接枝物的抗氧化性、乳化活性和乳化稳定性、凝胶强度和持水性、起泡性和泡沫稳定性均在一定程度上有所改善。

超声波技术作为一种快速、无毒且节能的新兴技术，能有效改善酪蛋白美拉德产物的功能性质。而对于超声技术促进美拉德反应机理的阐述却较为笼统，因此，构建反应动力学模型，结合产物结构及功能性质表征，探究超声加速美拉德反应的反应机理还有待深入研究，从而实现美拉德反应修饰酪蛋白的定向调控。另外，过高的超声功率可能会产生丙烯酰胺和5-羟甲基糠醛等有害成分，因此，超声波技术带来的负面影响也需要正确评估。

2.2.2 微波技术

微波是一种波长为1 mm～1 m、频率为0.3～300 GHz的电磁波。微波技术因其高节能等优势已广泛应用于食品加工领域，包括辅助提取、加热、干燥、巴氏杀菌和食品保鲜等[27]。

近年来，国内外研究学者研究了微波场中的美拉德反应。研究发现，微波加热可导致蛋白质中的二硫键断裂、疏水性基团暴露，有利于蛋白质结构的展开。此外，微波处理还可以通过解开碳链间的缠结促进多糖分子的重排及其相互作用[28]。微波引起的这些变化有利于美拉德反应在温和的条件下高效进行。研究表明，影响蛋白-多糖共价反应及产物性能的微波条件主要是微波功率和反应时间。Ge Huacai等[29]研究了微波功率对丙烯酸接枝壳聚糖反应的影响，结果表明，丙烯酸-壳聚糖的接枝度和接枝效率均随着微波功率的增大而显著升高，且使接枝产物达到相同的吸水性，传统干热法需240 min，而微波辐射（120 W）仅需30 min，反应速率提高了8 倍。另外，微波加热能显著改善酪蛋白的功能性质。毕伟伟[30]研究结果表明微波加热可以稳定地促进美拉德反应的进行，与水浴加热相比，微波加热的酪蛋白二硫键含量变化显著、荧光强度增加，β-转角含量上升。此外，微波加热可显著提高酪蛋白-β-环糊精的凝胶性、持水性、表观黏度、起泡性和泡沫稳定性以及自由基清除率。另一项研究发现，微波场内酪蛋白-乳糖体系的流变性发生了改变，酪蛋白在等电点处的溶解度有所改善，且其在消化过程中抗氧化活性显著提高[31]。

然而，微波加热的不均匀性是微波技术的短板，可能会影响食品质量，因此，应继续对该领域深入研究，以期避免微波产生的冷点和热点。

2.2.3 脉冲电场技术

脉冲电场技术是一种新兴的非热食品加工技术，其优势在于效率高、能耗小、副产物少，对环境友好且能够充分保护物料的风味特征等[32]。国内外研究学者发现，脉冲电场技术在增强蛋白质和多糖之间的相互作用中发挥着重要作用[33]。有研究者认为，蛋白质-多糖混合溶液经脉冲电场技术处理后能够降低化学反应的活化能[34]，电化学反应产生的自由基会使蛋白质二级结构部分展开，疏水性基团和自由巯基暴露[35]。同时，脉冲电场提供的电能可使多糖链分解[36]。这些变化有利于增加反应分子之间的碰撞概率，促进蛋白质和多糖之间的共价结合。研究发现，利用脉冲电场技术（总处理时间7.35 ms、电场强度范围10～30 kV）可成功制备牛血清白蛋白-葡聚糖美拉德产物，且其功能特性如溶解性、乳化活性、抗氧化性以及乳液稳定性都得到了显著改善[37]。

然而，国内外关于脉冲电场技术辅助美拉德反应修饰酪蛋白的相关文献还鲜有报道，但基于相关理论，此种方法对酪蛋白的美拉德反应修饰是非常可行的。此外，脉冲电场技术还不能大规模地应用于美拉德反应产物的制备中，且脉冲电场技术处理的临界强度和热效应之间的关系还没有得到充分的研究论证，还需进一步的研究。

2.2.4 静电纺丝技术

静电纺丝是一种利用静电作用力将聚合物溶液或者熔体转变为微纳米纤维的技术。在静电纺丝过程中，蛋白质-多糖混合射流通过电场时，电荷在其表面积聚。这些不均匀分布的电荷会引起射流的无定向喷射，导致蛋白质和多糖分子之间的重新排列和更为紧密的接触。溶剂经加热后蒸发，蛋白质和多糖紧密包裹成具有高比表面积和多孔性的干纤维[38]。这些特性有助于蛋白质和多糖在较为温和的反应条件下进行美拉德反应，从而避免不期望的褐变发生。

静电纺丝技术已成功应用于蛋白质和多糖的美拉德反应产物的制备方法中[39]，Kutzli等[40]采用静电纺丝技术结合加热处理制备乳清分离蛋白-麦芽糊精接枝物，并获得了最高产率（（44.52±7.46）%）。此外，静电纺丝辅助美拉德反应制备的接枝物在其功能特性上也得到了极大地改善。Kutzli等[41]通过静电纺丝法制备豌豆分离蛋白-麦芽糊精纤维，并在加热时间12 h/24 h、加热温度65 ℃/70 ℃、相对湿度75%的条件下进行美拉德反应，研究结果表明，较高的温度和较长的反应时间会促进美拉德反应；并且与未加热的纤维相比，美拉德反应产物具有更高的蛋白溶解度。这种方法改善了蛋白的功能特性。因此将静电纺丝技术与传统干热法相结合，可使美拉德反应产物的商业化制备成为可能。然而，国内外关于静电纺丝技术辅助美拉德反应修饰酪蛋白的相关文献还鲜有报道，因此其对酪蛋白的功能性质及结构表征还有待深入研究。

2.2.5 高静水压技术

高静水压处理技术作为一种新型的非热食品加工技术，普遍应用于果蔬、乳制品及肉制品加工中，且主要用于食品的杀菌[42]、保藏[43]以及生物活性成分的提取[44]等。但国内鲜有研究报道高静水压在蛋白-多糖共价结合方面的应用，国外的一些学者却已逐步将高静水压技术运用到蛋白-多糖的美拉德反应中，以提高其反应速率以及蛋白质的功能特性。

Ma Xiaojuan等[45]在研究不同氨基酸-糖模型体系中高静水压技术对美拉德反应的影响时发现，在赖氨酸-糖模型体系中，Amadori化合物的降解速率降低，而在精氨酸-糖模型体系中，其降解速率增加；此外，研究还表明除了高静水压对美拉德反应造成的影响外，高温也能加速美拉德反应的发生。Tian Yuting等[46]研究了高静水压处理对红曲米酒在陶器贮存期间挥发性成分的变化和感官品质的影响时发现，高静水压处理可显著降低酒中杂醇类的含量并保持内酯的浓度，贮存18个月后，经高静水压处理的酒总糖分下降更快，游离氨基酸含量更低，酮含量更高，这些变化可归因于高静水压处理加快了体系中美拉德反应和氧化反应的反生。Santos等[47]在一项类似的研究中同样得出了高静水压处理可加速酿酒体系中美拉德反应的发生。

目前，关于高静水压法对蛋白-多糖共价复合反应的影响的研究还略显不足，关于高静水压的工艺条件、压力对不同种类的蛋白与多糖共价反应的影响，以及压力对共价复合产物性质的影响等还需要做进一步深入的研究。

3 美拉德反应修饰酪蛋白作为递送载体的类型

作为一种绿色安全的蛋白改性方法，美拉德反应不仅能改善蛋白质的功能特性，还赋予了食品诱人的色泽和浓郁的芳香。因此，研究人员将蛋白质与糖的美拉德反应产物作为食品级递送系统的新型载体来封装、保护和控制生物活性物质的释放，以期提高其生物利用率。下文介绍了基于美拉德反应修饰的酪蛋白作为递送载体的不同类型，包括乳状液、复合凝聚物以及纳米递送载体。

3.1 乳状液

乳状液是一种以水包油或油包水形式稳定分散相的功能因子传递体系，可将疏水性生物活性物质及其他功能因子包裹在乳状液油滴中，从而提高其在水溶液中的稳定性和溶解度[48]。以蛋白质为载体制备的乳状液体系易受到pH值、离子强度、温度以及消化酶等因素的影响而发生聚集以及相分离，此外，乳状液是热力学不稳定系统，往往会由于乳析、絮凝和聚合等不稳定现象导致破乳，不能完全满足有效载体体系的要求[49]。所以必须用其他方法改善乳状液的性能。乳状液的稳定性与乳化剂有关，乳化剂可以吸附在油滴表面形成界面层[50]。酪蛋白作为一种大分子乳化剂，通过美拉德反应将蛋白质和多糖共价连接在一起形成新的乳化剂，其界面膜及其所带的静电荷间排斥作用和空间位阻共同使得热力学不稳定的两相混合体系具有长期稳定性[51]，以此可解决上述问题。

越来越多的研究已经证实，通过美拉德反应制备的酪蛋白-多糖共聚物作为乳化剂可明显改善乳状液的物理化学稳定性[52]。Wang Lixin等[53]在干热条件下制备了由酪蛋白-羧甲基壳聚糖共聚物稳定的水包油乳状液，研究发现，与单一酪蛋白稳定的乳状液相比，共聚物稳定的乳状液具有更高的冻融稳定性、pH稳定性、热稳定性以及贮藏稳定性。O’regan等[54]研究了VB12在由酪蛋白酸钠-麦芽糊精接枝物稳定的双重乳液中的稳定性和释放特性，与纯蛋白质稳定的乳液相比，美拉德改性复合物由于可以在油滴周围形成致密的保护膜，减少水相和油滴的接触，防止油滴聚结而具有更小的乳液粒径和更稳定的空间结构。此外，该递送体系在生物活性物质的生物利用度和控释方面均有所提升，使其成为有前景的生物活性物质递送载体[55]。Gumus等[56]将叶黄素包埋于由酪蛋白和葡萄糖经美拉德反应稳定的乳状液中，美拉德反应产物稳定乳液与单纯的酪蛋白稳定的乳状液相比具有更高的pH稳定性，这可归因于葡聚糖产生的空间位阻和静电排斥作用防止油滴聚集；体外胃肠模拟实验表明，美拉德改性酪蛋白乳液能有效抵抗胃蛋白酶的消化。

由此可见，以美拉德酪蛋白-多糖共聚物作为乳化剂形成的乳状液具有更高的物理化学稳定性，在制备功能性饮料方面具有良好的应用前景。此外，当酪蛋白与多糖通过美拉德反应形成共价复合物时，多糖阻碍了胃蛋白酶对酪蛋白的水解，从而使其在胃中具有较高的稳定性[57]，这使得此种递送载体可用于设计肠道特异性药物的传递，从而预防或治疗肠道疾病。

3.2 复合凝聚物

复合凝聚法是一种新兴的包埋技术，是指带相反电荷聚电解质间发生去溶剂化而导致相分离，最后形成了两相体系，即富含去电解质的凝聚相和与之平衡的稀释相[58]。复凝聚反应形成的可溶性复合物或者复聚物作为活性物质的递送载体已成功应用于β-胡萝卜素[59]、功能性油脂[60]以及益生菌[61]等的包埋，并显示出了高包封率和控释能力[62]，而广泛应用于食品与医药领域[63]。

值得注意的是，蛋白质-多糖复合凝聚物主要依靠静电相互作用、氢键、疏水键和空间位阻等非共价键相互作用形成[64]，这些作用力又容易受到离子强度、温度、电荷密度、pH值以及体系浓度等条件的影响，导致复凝物出现聚集现象，从而影响体系稳定性[65]。目前常用交联剂的交联作用通过表面修饰降低颗粒的表面能，从而减少颗粒的聚集[66]。但是化学交联剂（如戊二醛）存在一定的安全性问题，而酶类（如转谷氨酰胺酶）对pH值、底物和温度有严格的要求，都不适合食品工业化的生产[67]。近年来，由蛋白质和糖通过美拉德反应产生的共价接枝复合物通过增加空间排斥作用稳定复合凝聚体，进而用于包封活性物质，获得了越来越多的关注[68]。Ifeduba等[69]将硬脂酸大豆油包埋于经美拉德改性的明胶-阿拉伯胶复合凝聚体中，研究发现，与未改性体系相比，美拉德改性的微胶囊表现出更高的胶体稳定性和抗氧化能力。研究者还将其应用于酸奶中，在80 ℃下加热30 min时，美拉德改性的微胶囊表现出了更高的热稳定性，且其在冷藏14 d内也表现出了更高的氧化稳定性[69]。美拉德改性的微胶囊体系氧化稳定性的提高可能是由于美拉德反应产物可以通过螯合金属离子、自由基链和过氧化氢的分解、活性氧的清除，显示出优异的抗氧化能力。Zhou Huihui等[70]制备了由明胶-葡聚糖美拉德接枝物稳定的复合凝聚体包埋茶多酚，平均粒径为86 nm，体外胃肠模拟实验表现出了其对茶多酚的高负载率和缓释作用。此外，茶多酚对人乳腺癌细胞MCF-7具有抗肿瘤活性，噻唑蓝实验结果表明，游离茶多酚与复合凝聚体包埋的茶多酚相比，细胞活性无显著差异，这为开发茶多酚的递送体系治疗乳腺癌提供了科学的指导方法[70]。

由此可见，基于美拉德反应的蛋白质-多糖复合凝聚物可成功应用于生物活性物质的递送载体中，并能显著提高递送体系的稳定性，在包埋益生菌和功能性油脂方面显现出了极大优势，可作为功能性食品的开发应用于食品工业中。此外，还可作为药物递送载体应用于医药领域。然而，美拉德反应修饰的酪蛋白基复合凝聚物的功能性质、结构表征以及在生物活性物质的递送方面的报道较少，还有待进一步深入研究。

3.3 纳米递送载体

纳米递送载体是指利用机械或化学方法制备的平均粒径为10～1 000 nm的递送体系，有研究表明，运用纳米尺度的载体递送生物活性物质，不仅可以在食品加工、贮藏过程中提高生物活性物质在氧气、pH值、酶解等极端条件下的稳定性，还可以更有效地调控被包埋的生物活性物质的溶解性、稳定性、释放速率以及在消化道中的滞留情况[71]，以及影响载体的消化特性，如胃蛋白酶对蛋白质的水解和脂肪酶对脂质的水解等。因此，纳米载体递送是生物活性物质理想的生物效价增效途径[72]。而递送载体对生物活性物质的递送特性以及对其生物效价的增效作用是与载体的尺寸大小密切相关的，当载体的粒径小于500 nm，尤其是小于100 nm时，可显著地提高被递送生物活性物质的生物效价，而且当载体粒径为10～100 nm时，纳米载体可通过上皮细胞渗透、肠细胞和M细胞转运等方式直接进入血液循环中，从而更有效地提高活性物质的生物效价[73]。

酪蛋白作为一种天然生物大分子，绿色、安全、生物相容性好等特征赋予其得天独厚的优势，使其作为营养素纳米载体的研究日益受到关注。Wei Xuelin等[74]成功制备了负载酚类物质咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester，CAPE）的酪蛋白纳米靶向给药系统，其粒径分布均匀（（211.0±5.1）nm），并在室温下贮存4 周后保持稳定；通过傅里叶变化红外光谱和圆二色光谱分析证实了CAPE通过疏水作用与酪蛋白结合。天然酪蛋白在等电点附近pH值条件下溶解性和乳化性较差，且易受胃蛋白酶消化，目前美拉德反应是蛋白改性中最为理想的方法之一。

一些具有生物活性的抗氧化组分包括类胡萝卜素、多酚、黄酮类等可预防心血管疾病、抗炎、抗癌和清除自由基等多种生物学功能，但其极易氧化，研究表明，可通过酪蛋白基纳米递送载体包埋从而提高其抗氧化性及生物利用率[75]。Sun Xianbao等[76]通过美拉德反应制备酪蛋白-麦芽糊精接枝物，并成功包埋原花青素（procyanidins，PAs），得到了酪蛋白-麦芽糊精PAs纳米颗粒（casein-maltodextrin-PAs nanoparticles，CMPN），其粒径和包封率分别为（158.69±1.70）nm和（93.48±0.20）%。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)阳离子自由基清除实验表明，CMPNs的体外抗氧化活性在28 d贮藏期和不同温度条件下（40、60 ℃和80 ℃）均保持良好的稳定性。细胞内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力的分析也证实了CMPNs抗氧化保护作用的存在。在体外释放实验中，与游离PAs的快速释放（释放率80%）相比，包埋后的PAs1在20 min后的释放率仅为30%，表明经纳米载体包埋的PAs在很大程度上防止了胃蛋白酶的降解，这可能是由于糖基化蛋白质较大的空间位阻覆盖了蛋白质上的酶水解位点，提高了其稳定性和生物利用率[76]。Xue Jin等[77]将表没食子儿茶素没食子酸脂（epigallocatechin gallate，EGCG）包埋于美拉德反应修饰的酪蛋白中，发现修饰后的酪蛋白对EGCG有较强的包封和保留能力，能有效保护EGCG在碱性pH值下的降解，并在肠液中表现出缓慢而持续的释放。

以上研究结果表明，经美拉德反应修饰的酪蛋白作为纳米递送载体是生物活性物质理想的生物效价增效途径。

4 美拉德反应修饰酪蛋白运载体系在消化系统中的靶向释放

有研究已证实，递送载体包埋生物活性物质能有效提高其稳定性，保护被包埋物质免受光照、温度、pH值、离子强度等环境因素的影响而降解[78]。但由于生物活性物质的口服生物利用度低，而使其潜在的促进健康作用并未完全实现，因此，如何提高各种生物活性物质的生物利用度，充分发挥其生理功能已成为研究热点。目前已经有研究人员设计了一些递送体系提高生物利用率，主要通过保护被包埋物质不被胃蛋白酶水解，并在肠道pH条件下实现控制释放以及实现靶向释放，从而改善生物活性物质的口服吸收效果[79]。

4.1 胃

食物在经过口腔的初步消化后，通过食管到达胃，并与胃液混合。盐酸、胃蛋白酶原和电解质等是胃液的主要成分。以蛋白质为乳化剂的乳状液在胃消化过程中通常会由于pH值变化导致电荷损失、离子强度增强发生静电屏蔽以及胃蛋白酶的水解作用，导致递送体系发生显著变化[80]。美拉德改性复合物相比单一蛋白质稳定的乳状液相比，其在胃消化过程中通常具有更高的稳定性。Davidov-Pardo等[81]将白藜芦醇包埋于酪蛋白酸钠-葡聚糖美拉德复合物纳米颗粒中，在模拟胃液条件下，不含复合物的纳米颗粒悬浮液的粒径显著增加（＞1 000 nm），而改性复合物纳米颗粒悬浮液的粒径增加较小（约为530 nm），这可能是由于葡聚糖产生了较大的空间位阻以及美拉德修饰导致蛋白质上的酶水解位点减少，有效阻止了颗粒的絮凝和聚结，从而提高了美拉德改性复合物稳定的纳米颗粒在胃消化过程中的稳定性。

Qiu Jiahuan等[82]通过干法美拉德反应制备酪蛋白-卡拉胶纳米胶囊包埋辣椒红色素（paprika oleoresin，PRP），在胃液中孵育3 h后，未经美拉德反应的物理混合物的平均粒径和聚合物分散性指数（polymer dispersity index，PDI）值由513.4 nm和0.236增大到1 025.6 nm和1.000，而改性复合物的平均粒径和PDI值分别由306.8 nm和0.153增加至575.9 nm和0.460，且其在孵育0.5 h后的释放速率分别为56.2%和13.6%，由此可见，改性复合物纳米胶囊在模拟胃液中具有相对较好的稳定性，并且PRP仍能与美拉德修饰产物有效结合，维持分散状态，从而有利于其进入肠道完成释放与消化。这可归因于蛋白酶水解蛋白或多肽时，其倾向于剪切疏水氨基酸之间的肽键，即κ-酪蛋白肽键断裂，这破坏了物理混合物中酪蛋白结构，酪蛋白之间聚集沉淀，导致物理混合物中PRP的快速释放并且累计释放率较大。而酪蛋白共聚物纳米粒将疏水氨基酸保护在内核区域，使表面形成了具有保护作用的界面层，防止了胃蛋白酶和低pH值对其剪切和破坏，另外，PRP被包埋在疏水内核中，其空间位阻和范德华力也是阻止胃蛋白酶对PRP作用的重要因素，使得PRP不完全释放，从而保持结构相对稳定[82]。

4.2 小肠

经胃消化后的食糜进入小肠后与肠液混合，小肠液呈弱碱性，pH值约为8～9，主要包括胰液和胆汁。小肠是食物营养物质吸收的主要场所。

在Qiu Jiahuan等[82]的研究中，模拟小肠消化后，酪蛋白-卡拉胶美拉德反应改性复合物纳米胶囊包埋PRP的释放量和释放速率均略高于混合物，这说明共聚物的形成及包埋并未对在肠液中PRP的释放产生影响。Larissa等[83]分别制备了酪蛋白酸钠-麦芽糊精和酪蛋白酸钠-葡萄糖美拉德改性复合物包埋白藜芦醇，在模拟肠液条件下，白藜芦醇的释放量在3 h内达到了90%。胰蛋白酶首先作用于共聚物表面的κ-酪蛋白，将其位于116～117位的赖氨酸残基的羧基端肽键切断后形成不同分子质量的多肽，导致共聚物结构被破坏，最后共聚物被完全水解，核内生物活性物质得到释放。由此可见，共聚物表面所接枝的多糖形成的界面层对胰复合酶基本无阻碍作用。

美拉德反应修饰酪蛋白改性复合物作为生物活性物质的递送体系，能在消化过程中防止或减少生物活性成分的降解，并将其充分转运和溶解到混合胶束中以供小肠吸收。由此，其可作为理想的生物活性载体，有效提高生物活性物质的生物利用度。

5 结 语

本文综述美拉德反应修饰酪蛋白的制备方法，在传统方法的基础上加以新兴技术（超声波、微波、脉冲电场、静电纺丝以及高静水压技术）的辅助，能够实现制备效率的提高和功能性质的改善；美拉德反应制备的酪蛋白-多糖共价复合物作为生物活性物质的递送载体类型，包括乳状液、复合凝聚物及纳米递送载体；探究递送体系在胃肠模拟环境中的变化。大量研究表明，美拉德反应修饰酪蛋白作为生物活性物质的递送载体显著提高了其环境稳定性和生物利用率，使其能广泛应用于食品工业化的生产中。然而，对于美拉德反应产物功能特性的验证、控制反应过程中有害物质和晚期产物的生成以及选择较为合适的美拉德产物设计不同生物活性物质的递送载体还需进一步研究。