浅议马铃薯茎尖培养脱毒技术在延安地区的应用与发展

邓长芳 郑太波 杜红梅 党菲菲 霍延梅 李 媛

（延安市农业科学研究所 陕西延安 716000）

马铃薯具有抗旱、抗寒、耐贫瘠的特点，是延安市仅次于玉米的第二大粮食作物，种植历史悠久，种植面积常年维持在6.67万hm2左右，平均产量10～15 t/hm2[1]。马铃薯在无性繁殖过程中极易受到病毒侵染，目前已发现的侵害马铃薯的病毒有30多种，其中危害程度严重的有 PVY、PLRV、PVX、PSTV、PVA和PVS 6种[2]。这些病毒的危害程度会随着马铃薯的世代叠加而逐年加剧，从而引起马铃薯植株愈加矮小，叶片卷曲，严重影响马铃薯产量和营养价值[3]。马铃薯茎尖培养脱毒技术是利用马铃薯细胞的全能性及病毒在马铃薯不同部位分布不同的特性，应用无菌技术在培养基中培育马铃薯植株分离组织和细胞的技术[4]，可有效缓解病毒对马铃薯的危害，解决马铃薯种性退化的问题。该方法能够在短时间内培养大量无病毒苗，同时还保持了马铃薯的优良性状[5-6]，已成为马铃薯脱毒种薯产业的基础，优质便捷的茎尖培养技术也促进了脱毒种薯产业的发展。本文作者主要总结了马铃薯茎尖培养脱毒技术的基本原理、操作流程、影响因素，以及该技术在延安地区的应用和发展，以期为马铃薯脱毒技术良种繁殖体系的构建和优质高效的生产种植提供实践经验，从而有效推动本地区马铃薯产业的健康发展。

1 茎尖培养脱毒技术的原理

感染马铃薯植株的病毒在植物体内并不是均匀分布的，越靠近茎顶端的区域病毒感染度越低，生长点（0.1～1.0 mm区域）几乎不含或很少含有病毒。因此，所谓茎尖培养脱毒就是将马铃薯的茎尖或芽尖，在无菌的条件下切取0.1～0.3 mm，接种在提前配制好的培养瓶中进行培养，由此发育成小植株，再采用电子显微镜、指示植物等方法进行病毒鉴定，未表现出病毒病症的植株即为无病毒植株，用无病毒植株在隔离条件下繁育的薯块为脱毒种薯[7]。

2 茎尖培养脱毒技术的操作流程

2.1 外植体的选取与消毒

选取由种薯长出的幼芽，去除不需要的部分后用洗洁精涮洗，并修剪成2～4 cm的顶芽放入烧杯中用蒸馏水反复漂洗干净，滤干水分放入超净工作台。用70%酒精消毒10～30 s，酒精蒸发后剥除外层，用0.1%HgCl2灭菌 5～8 min，蒸馏水涮洗 4～5 次，再用无菌水涮洗8～10次后放入培养皿中待分离。

2.2 培养基的制备

采用MS或MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3+0.1 mg/L NAA为培养基，培养基配成后向100 mL的容器内装入30～40 mL的培养基，密封后放入0.1 MPa、121℃的灭菌锅内消毒灭菌20 min。

2.3 分离与接种

接种前4 h用0.3%高锰酸钾溶液消毒熏蒸并开紫外灯进行灭菌，接种前20 min打开超级工作台内的紫外灯对实验所用器材、瓶苗、培养基等进行再次消毒；工作人员在缓冲间换好实验服用流动水清洗干净双手后进入接种室，用70%酒精拭擦双手特别是指甲处。将要切取的茎尖或茎段等外植体材料放置在生物显微镜上，用解剖针或解剖刀将尖端切割成含有一个叶原基（0.1～0.3 mm）的小段；打开培养基瓶盖，将瓶口放酒精灯火焰上方转动，同时，将镊子放酒精灯火焰上灼烧消毒，然后用镊子夹取切割好的茎段或茎尖轻插入培养基内。初代培养一般每瓶转接1个茎段或茎尖，完成一瓶接种后，用过的镊子、解剖刀再次放入95%酒精中消毒，培养瓶及瓶盖再火烤数秒后上盖拧紧；分割完一只外植体材料后要及时更换培养皿中的滤纸，每瓶培养基接种前都要将器械进行消毒灭菌以避免交叉感染。

2.4 离体培养

一般情况下，离体培养的温度控制在23～25℃，光照度最好在3 000 lx，光照时长16 h，将转接好的培养瓶苗放置于培养室的培养架中培养3～5周的时间。

2.5 病毒鉴定

经过茎尖培养得到的植株，可采用电子显微镜检查法、抗血清鉴定法、指示植物法、酶联免疫鉴定等方法测定是否携带病毒，把有毒植株及早清除掉，保留无毒植株，作为脱毒苗隔离加速繁殖。

3 茎尖培养脱毒技术的影响因素

3.1 培养基的成分

培养基是植物组织培养的重要基质，决定了组织培养过程的成败，其主要成分包括水、有机物、无机盐、植物激素等，除此之外，马铃薯培养基内还需加入固化剂。目前常用的培养基有Morel、MS、MA、农事和革新等[8]。不同品种马铃薯所需培养基的营养成分也不尽同，如费乌瑞它适合氮、磷、钾浓度较高的培养基[9]；在缺铁的培养基上，陇薯7号叶片发黄，但陇薯20号可正常生长[10]；克新1号在常规培养基和仅含大量元素培养基上，株高、茎粗无显著差异，说明克新1号对微量元素需求较小[11]。当培养基中适当添加植物激素，可以提高茎尖成活率，促进茎尖组织分化成苗，但激素用量过低效果不显著，用量过高则可能会效果相反。即使是同一品种，不同地区培养基成分也有所不同。因此，在培养过程中，应根据当地的实际条件，筛选出适宜的培养基配方进行培养基的制备，通过适宜的培养条件提高茎尖成活率。

3.2 茎尖的选取

茎尖的大小是脱毒效果和茎尖成活的关键。茎尖越大，再生植株越容易存活，但脱毒效果就越小；茎尖越小，虽然脱毒效果理想，但植株成活较难，尤其是PVX和PVY病毒，它们的脱毒效果和茎尖的大小呈负相关。王秀英等[12]研究认为，茎尖大小的最佳选择一般在0.2 mm以下；而齐恩芳等[13]在陇薯6号中发现，切取2个叶原基时的茎尖脱毒效果最突出。叶原基决定了茎尖分生组织的生长分化能力，所以茎尖大小应以生长点带的叶原基数目和其邻近组织大小为标准，且通常带1～2个叶原基，这种大小的茎尖才既能脱除大多数病毒，又能保持一定的成苗率。

3.3 病毒的种类

由于马铃薯病毒的种类不同，对茎尖的脱毒效果也有很大的影响。目前，马铃薯病毒的脱除难度由易 到 难 排 列 如 下 ：PLRV、PVA、PVY、PAMV、PVM、PVX、PXS和PSIVd，但该顺序也会随病毒株系、培养条件、品种不同而有所变化[14]。研究表明，采用茎尖培养与热疗法能够成功脱除怀玉山高山马铃薯的PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV 病毒[15]；电疗法对PVX、PVY、PLRV、PVA、PSTVd 等多种病毒具有明显的脱除作用[16]。

3.4 培养的条件

马铃薯茎尖培养所需的光照度随发育时期逐渐增加，茎尖培养初期的最佳光照度是1 000 lx，1个月后增加至2 000 lx，大约2个月，光照度应增加至4 000 lx。马铃薯茎尖的培育温度没有特定要求，但温度过低和过高都不利于茎尖生长发育。因此，在标准室温（25±2）℃培养即可。

4 延安市脱毒马铃薯发展现状

延安市的马铃薯脱毒技术工作主要由延安市农业科学研究所负责开展。自2005年以来，该所利用组培实验室对克新1号、大西洋、费乌瑞它、青薯9号等品种进行茎尖脱毒培养，经过多年试验研究，总结出马铃薯 “茎尖脱毒→病毒检测→初代培养→继代培养→生根培养→炼苗移栽”脱毒苗繁育体系，“移苗→炼苗→扦插→浇水→施肥→防病虫→收获”原原种生产技术体系和 “脱毒苗→原原种→原种→良种”种薯繁育技术体系三大体系，建立了市、县、乡三级从基础种到合格种的协作繁种技术体系，属省内首创，2015年获得延安市科学技术一等奖。近几年，通过科技成果有效转化，脱毒种薯普及率明显提高，截止2018年底，累计繁育马铃薯脱毒种苗184.6万株，原种258.44万粒，原种94.45 t，一级良种1.17万t，二级良种4.8万t，种植脱毒种薯119.02万亩，脱毒种薯普及率在80%以上，解决了马铃薯生产中品种结构不合理、繁种育种体系不健全、脱毒种薯覆盖率低、栽培技术缺乏等问题，有效提高了当地薯农的生产水平，加速了马铃薯无公害、绿色、有机生产的进程，对提高延安市马铃薯产量和品质改良起到了积极的推动作用。