血清miR-210与新生儿呼吸窘迫综合征严重程度和预后的关系

杜志云，史亦男，许海娟，李书秀*

(1.河北省秦皇岛市第一医院新生儿科，河北 秦皇岛 066000；2.河北省秦皇岛市第一医院儿科ICU，河北 秦皇岛 066000)

新生儿呼吸窘迫综合征(neonatal respiratory distress syndrome，NRDS)是临床常见的一种儿科疾病，主要由于缺乏肺泡表面活性物质所引起，致使肺泡进行性萎陷[1]，患儿出生46 h内出现进行性呼吸困难、发绀、吸气等症状[2]，严重时会导致呼吸衰竭。研究指出，NRDS病因主要与肺表面活性物质合成分泌不足有直接关系，病情进展较快、病死率较高，胎龄越小、发病率越高，是威胁新生儿生命的危重症之一[3]。NRDS的临床诊断主要依靠一般病史、临床表现以及影像学检查结果，但由于新生儿的特殊性，实验室检查以及影像学检查较为复杂，因此寻找一种准确、便捷的诊断方式对NRDS患儿具有重要意义。微小核糖核酸(mircoRNA，miRNA)是一种新型的基因调控因子，在急性NRDS发病过程中发挥重要作用[4]。近年来研究发现，miR-210在多种炎症性肺疾病发生中表达水平出现变化，参与了多个信号通路以及免疫炎症反应过程[5]。目前关于miR-210与NRDS相关性的研究较少。本研究通过检测NRDS新生儿血清中miR-210血清水平，分析该血清表达与病情严重程度的相关性以及对预后的影响，为临床提供参考依据。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 收集2017年1月—2020年12月我院收治的NRDS新生儿104例，男性57例，女性47例；胎龄27～41周，平均(32.24±1.05)周；出生体重(1 688.47±50.54)g；足月儿48例、早产儿96例。纳入标准：①所有患儿均符合《新生儿急性呼吸窘迫综合征蒙特勒(2017年版)》[6]中的相关诊断标准；②经影像学检查与临床体征检查确诊，X线片显示双肺弥漫性阴影伴肺水肿改变，超声心动图检查无左心房高压表现；③胎龄>27周；发病急，机械通气3 d以上；④无肺外严重感染；⑤患儿家属知情同意且签署知情同意书。排除标准：①合并肺先天性心脏病、代谢紊乱等疾病；②合并肺部及胸壁畸形或其他严重先天畸形；③合并肺部表面活性物先天缺乏；④拒绝或不配合研究者。

本研究符合赫尔辛基宣言中关于医学伦理的相关建议，经医院医学伦理委员会批准通过。

1.2方法

1.2.1分组 方法以新生儿诊断为NRDS为研究起点，痊愈出院或治疗无效死亡为研究终点，根据患儿的预后将其分为生存组与死亡组。所有新生儿入院24 h后根据首次胸部X线片结果与病情严重程度将其分为轻度组(Ⅰ级、Ⅱ级)与重度组(Ⅲ级、Ⅳ级)。

1.2.2NRDS病情严重程度 ①X线表现等级：胸部X线片显示两肺野透亮度明显降低，且有细小颗粒和网状阴影为Ⅰ级；除Ⅰ级变化加重外，可见支气管充气征，延伸至肺野中外带则为Ⅱ级；病变明显严重，且肺野透亮度降低明显，并且心缘、膈面呈模糊样则为Ⅲ级；整个肺野呈白肺，支气管充气征更加明显，似秃叶树枝则为Ⅳ级。②新生儿急性生理学评分围生期补充Ⅱ[7](perinatal supplement of acute physiological score for neonates Ⅱ，SNAPPE-Ⅱ)：所有患儿确诊后12 h内使用该量表进行评分，总分值0～162分，得分越高，病情越严重。

1.2.3血清指标检测 所有患儿入院后采集空腹静脉血约3 mL，以3 000 r/min，离心10 min，离心后取上层血清，采用Trizol法提取血清总RNA，使用RTaseM-LAV逆转试剂盒逆转为cDNA应用实时荧光定量PCR(real-time fluoresent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测血清miR-210水平。miR-210上游引物：5′-ATGGTTC-GTGGGAGCCCCTGCCCACCGCA-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGTCCCGAGGT-3′。反应条件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，共40个循环。以U6为内参，上游引物：5′-CATCCGATAAAAT-TGGAACGA-3′，下游引物：5′-TTTGTGCGTG-TCATCCTTGCG-3′，采用2-△△Ct计算miR-210相对表达量。

1.3观察指标 ①比较生存组与死亡组患儿性别、胎龄、出生体重、母亲年龄、病因、剖宫产、双胎、羊水异常、miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ评分等基线资料。②比较轻度组与重度组患儿血清miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ评分。③绘制ROC曲线，分析血清miR-210水平对NRDS患儿死亡的预测价值。

1.4统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较采用独立样本t检验和配对t检验，计数资料比较采用χ2检验。采用Spearman相关性分析miR-210水平表达与NRDS病情程度的相关性，绘制ROC曲线分析血清miR-210表达水平以及SNAPPE-Ⅱ评分预测NRDS死亡的预测价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1死亡组与生存组一般资料比较 根据预后分组，104例患儿中预后较好81例(77.88%)，死亡23例(22.12%)。生存组miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ评分低于死亡组，差异有统计学意义(P<0.05)；2组性别、胎龄、出生体重、母亲年龄、病因、剖宫产、双胎、羊水异常等方面差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 死亡组与生存组一般资料比较Table 1 Comparison of general data between death group and survival group

2.2不同病情程度患儿血清miR-210水平与SNAPPE-Ⅱ评分比较 根据首次胸部X线片结果分组，104例患儿中轻度患儿73例，重度患儿31例。重度组miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ评分高于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。NRDS发生与血清miR-210水平呈正相关性(r=0.638，P<0.001)。

2.3血清miR-210水平与SNAPPE-Ⅱ评分相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，血清miR-210与SNAPPE-Ⅱ评分呈正相关(r=0.513，P<0.05)。

表2 不同病情程度患儿血清miR-210水平与SNAPPE-Ⅱ评分比较Table 2 Comparison of serum miR-210 levels and SNAPPE-Ⅱ in children with different severities of disease

2.4血清miR-210水平对预测NRDS死亡的价值 血清miR-210的最佳分界值为16.71 ng/L，ROC曲线下面积为0.763，OR=0.846，95%CI：0.892～1.064，敏感度为82.61%(19/23)，特异度为86.42%(70/81)，阳性预测值为82.61%(19/23)，阴性预测值为50.00%(4/8)。见图1。

图1 血清miR-210对NRDS患儿预后的预测价值

3 讨 论

NRDS又称为新生儿肺透明膜病，是新生儿出生后不久出现进行性呼吸困难、呼吸衰竭等症状的一种疾病[8]，主要由于肺泡表面活性物质缺乏，并且新生儿由于肺部发育不完全，其肺部更易受到损伤，因此新生儿呼吸窘迫症的发生率较高，但随着肺成熟度增加，其恢复率增大[9]。研究指出，NRDS多见于早产儿，早产儿胎龄越小，发病率越高，随着产前糖皮质激素预防以及出生后肺表面活性物质、正压呼吸机等综合治疗手段，促使早产儿患儿的发病率有所降低，且典型症状与病情严重程度呈降低趋势[10-11]。病情严重的NRDS患儿3 d内病死率较高，尤其是出生后第2天病死率最高，因此寻找一种快速有效评估预后指标对于提高新生儿生存率具有现实意义[12]。血清miR-210水平在呼吸道疾病的发生及发展中发挥重要作用，在多种呼吸道疾病发生、进展中起着重要作用[13]。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA因子[14]，在细胞内具有多种重要的调节作用，通过介导靶细胞基因转录本的降解或抑制其翻译，从而抑制相关基因的表达，进而影响生长、发育、分化、增殖等多种生理病理过程[15]。相关研究表明，miRNA参与了ARDS等疾病的发生与进展，在ARDS炎症反应以及细胞凋亡中发挥着重要的调控作用，同时miRNA在ARDS患者血清中表达发生变化，参与了上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞的病理生理过程，决定了ARDS患者的病情程度与预后[16-17]，因此miRNA有希望成为ARDS等疾病新型的生物标志物与新的治疗靶点。研究指出，miR-210是一种低氧激活因子，靶基因具有多样性，主要调控血管生成、细胞迁移、细胞分化、抑癌基因活性等诸多方面[18]。因此，miR-210在参与神经胶质瘤、周围神经鞘膜瘤等肿瘤的发生，也参与了脑血管疾病的修复过程，如诱导血管再生[19]、改善缺血区血供[19]、促进神经元再生[20]以及炎症反应[21]等。血清miR-210检测已被广泛用于多种神经疾病、脑卒中、心力衰竭、恶性肿瘤等疾病的诊断中。Mohammadhossein等[22]研究中发现，miR-210可在受损的组织部位呈异常表达，还可进入血液中，其变化程度与损伤程度保持一致，因此miR-210是判断病情程度与预后的重要标志物之一。本研究结果显示，生存组miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ评分低于死亡组，2组性别、胎龄、出生体重、母亲年龄、病因、剖宫产、双胎、羊水异常差异无统计学意义。提示，血清miR-210水平与SNAPPE-Ⅱ评分与NRDS患儿预后相关，血清miR-210表达水平升高，患儿预后较差。同时，血清miR-210表达与SNAPPE-Ⅱ评分呈正相关，血清miR-210表达水平升高时，SNAPPE-Ⅱ评分越高，患者预后越差，死亡风险越高。SNAPPE-Ⅱ评分是目前临床较为常用的一种新生儿危重病例评分系统[23]，可较全面的评估新生儿的危重症情况，具有良好的预测价值，可较为准确地预测新生儿危重疾病的预后情况。

本研究结果显示，轻度组患儿血清miR-210水平、SNAPPE-Ⅱ评分低于重度组，差异有统计学意义，提示血清miR-210水平对判断NRDS患儿病情严重程度具有指导意义，且其表达水平与病情严重程度呈正相关性。血清miR-210的最佳分界值为16.71 ng/L时，OR=0.846，95%CI：0.892～1.064，敏感度为82.61%，特异度为86.42%，对预测NRDS患儿预后具有较高价值。NRDS患儿易因气流阻塞而造成迷走神经兴奋性降低、交感神经张力的升高，并诱导造成心肌细胞缺氧[24]。而细胞或组织受到上述病理变化的刺激后会诱导miR-210表达的上调，通过miR-210表达的上调进行负反馈调节[24]，来减轻缺氧对细胞及组织造成的损伤。有研究表明，miR-210对缺氧后神经干细胞的存活和凋亡的调控过程中发挥重要作用[25]。此外，miR-210对血管生成与细胞迁移也有明显调控作用，可通过对靶分子受体酪氨酸激酶配体表达的抑制作用来调控及参与肺组织及心肌细胞等的损伤修复过程，有利于NRDS患儿病情的缓解级改善预后，可作为NRDS的潜在治疗靶点。国外研究证实，miRNA-210是HIF-1α依赖型miRNA，机体缺氧状态可随着HIF-1α的变化增强缺血缺氧细胞中miRNA-210的表达水平，并通过对缺氧内皮细胞迁移、分化的影响来减轻缺氧损伤，本研究结论与之一致[26]。也有研究发现，缺氧缺血大鼠模型的脑组织中miRNA-210表达出现下调[27-28]，本研究结果与之不同，考虑与该研究中miRNA-210表达的检测时间较晚，是在大鼠缺氧缺血后72 h才进行检测有关。

综上所述，miR-210表达水平与NRDS患儿病情严重程度密切相关，其表达水平越高NRDS患儿病情越严重，预后越差。当清miR-210的最佳分界值为16.71 ng/L时，对预测NRDS患儿预后具有较高价值，miR-210检测有望成为NRDS潜在的预后标志物与新的治疗靶向。