HSF1、sMR、miR-758-3p在肝癌患者中的表达及与临床病理特征的关系

赵国杰，杨宏伟，赵鹏飞

(1.河北省邯郸市中心医院普外二科，河北 邯郸 056000；2.河北省邯郸市中心医院肿瘤一科，河北 邯郸 056000；3.河北省邯郸市第七医院外四科，河北 邯郸 056000)

肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是指发生于肝脏的恶性肿瘤，是临床上常见的恶性肿瘤[1-2]，其发病率和病死率较高且呈逐渐上升趋势[3]。HCC患者早期没有明显的临床症状[4]，后期伴随病情进展会出现腹痛、腹泻、腹胀、呕吐、消瘦等临床症状[5-6]。HCC不仅会导致患者剧烈的疼痛，还可能会因其导致的食管静脉曲张的破裂大出血而直接导致死亡，对人体危害大。因此，提高对HCC的诊断水平有助于疾病的预防和治疗。近年来甲胎蛋白被广泛应用于HCC的临床检测，但肝炎、肝硬化等疾病患者的甲胎蛋白也会出现异常表达，从而影响其用于HCC检测的可信度[7]。热休克转录因子1(heat shock transcription factor 1，HSF1)通过编码蛋白质调控细胞内参基因的稳态促进蛋白质合成、细胞增殖和糖代谢，参与HCC发生发展[8]。可溶性甘露糖受体(soluble mannose receptor，sMR)是一种新型血清巨噬细胞激活的标志物，由甘露糖受体在细胞膜上裂解基质金属蛋白酶形成，可以参与维持内稳态、识别病原、诱导细胞因子、抗原递呈等过程[9]。研究表明，慢性病毒性肝炎患者血清sMR水平呈高表达并且与病情密切相关[10]。研究表明，miR-758-3p对癌细胞的增殖、迁移、侵袭具有抑制作用[11]。上述三种指标与HCC有着密切的联系，而在国内暂未见三种指标联合用于HCC诊断的报道，所以本研究旨在探讨HCC患者HSF1、sMR、miR-758-3p水平变化并分析其与临床病理特征的关系，为肝癌患者的临床诊断与治疗提供新思路。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选取2020年9月—2021年6月来我院进行手术治疗的68例肝癌患者为试验组，另取同时间段来我院就诊的42例慢性肝炎患者为对照组。纳入标准：① 68例肝癌患者均符合《原发性肝癌诊疗规范(2019 版)》标准[12]；②临床基本资料完备。排除标准：①患有其他恶性肿瘤；②患有自身免疫系统疾病；③妊娠期及哺乳期患者；④患有血液系统疾病。2组性别、年龄、体重指数(body mass index,BMI)等临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

本研究经医院伦理委员会审批，患者知情同意并签署知情同意书。

表1 两组一般临床资料比较Table 1 Comparison of general clinical data between two groups

1.2方法

1.2.1免疫组织化学检测HSF1水平 手术中取肝癌患者癌组织制作切片，慢性肝炎患者取活检组织只做切片，切片脱蜡，高压热修复抗原，去除内源性过氧化物酶，加一抗HSF1(1∶450)(生产厂家：赛默飞世尔科技公司，规格：100 μg)，4 ℃过夜，PBS(生产厂家：赛默飞世尔科技公司，规格：250 g)水洗，加二抗(生产厂家：赛默飞世尔科技公司，规格：250 μL)，37 ℃孵育30 min，显色，苏木精(生产厂家：赛默飞世尔科技公司，规格：500 mL)复染，1%盐酸乙醇分化，脱水透明，中树胶封固。阳性表达呈棕黄色或棕褐色颗粒。每例选6个视野计算(400倍)。根据细胞染色计分[13]：无色：0分；淡黄：1分；棕黄：2分；棕褐：3分。根据阳性细胞百分数：<5%：0分；5%～10%：1分；11%～50%：2分；51%～75%：3分；>75%：4分。二者相乘，<3为阴性，≥3为阳性。

1.2.2酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA )检测血清sMR水平 抽取患者空腹静脉血5 mL，以3 500 r/min的速度离心10 min，取上清存于-80 ℃冰箱。根据ELISA试剂盒说明书步骤操作。于450 nm处用酶标仪测量其吸光度值，制作标准曲线。

1.2.3RT-qPCR法检测miR-758-3p表达水平 提取RNA，逆转录为cDNA，逆转录条件：65 ℃、10 min,37 ℃、60 min,85 ℃、5 min，所得c DNA保存于-20 ℃冰箱备用。cDNA扩增反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct相对定量法计算miR-758-3p相对U6的表达量，引物序列见表2。

表2 RT-qPCR引物序列Table 2 Primer sequences of RT-qPCR

1.3统计学方法 应用SPSS 23.0统计软件分析数据。 数据满足正态性分布，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两组研究对象HSF1表达情况比较 试验组HSF1阳性率、血清sMR表达水平高于对照组，miR-758-3p表达水平低于对照组(P<0.05)；免疫组织化学结果显示试验组HSF1阳性表达率高于对照组(P<0.05)，见表3，图1。

表3 两组研究对象HSF1表达情况比较Table 3 Comparison of HSF1 expression between two groups

图1 两组研究对象HSF1阳性表达(免疫组织化学染色 ×400)

2.2HSF1、sMR、miR-758-3p表达水平在不同临床病理特征组之间的比较 HSF1、sMR、miR-758-3p表达水平在有无淋巴结转移组、有无微血管侵犯组、不同病理分期组、不同AFP水平组之间差异有统计学意义(P<0.05)；在不同性别、年龄、BMI组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.3HSF1、sMR、miR-758-3p诊断肝癌的价值分析 HSF1、sMR、miR-758-3p诊断肝癌的截断值为1.500%，82.230 ng/L，0.845，曲线下面积为0.947，0.983，0.787，联合HSF1、sMR、miR-758-3p诊断肝癌的曲线下面积为1.000，高于单独诊断，见表5，图2。

表4 HSF1、sMR、miR-758-3p表达水平与临床病理特征的关系Table 4 Relationship between expression levels of HSF1, sMR and miR-758-3p and clinicopathological characteristics

表4 (续)

表5 HSF1、sMR、miR-758-3p诊断肝癌的效能分析Table 5 Efficacy analysis of HSF1, sMR and miR-758-3p in the diagnosis of hepatocellular carcinoma

图2 HSF1、sMR、miR-758-3p诊断肝癌的ROC图

3 讨 论

肝癌的发病率和病死率都较高，现阶段，在全球范围内，每年大约有60万人死于肝癌。由于肝癌患者早期症状不明显，其诊断、治疗及预后面临着巨大的挑战，所以找寻肝癌预测、诊断、治疗的相关指标成为临床研究的热点[14-15]。HSF1是关键的调节控制热休克蛋白表达的转录因子，由529个氨基酸组成[16]。HSF1通常以无活性单体形式存在于细胞质中，当受到温度骤增、短时间内缺血、炎症反应、氧化应激等刺激时，HSF1会被激活，转化为三聚体，经过核膜到达细胞核，启动下游靶基因转录，产生热休克蛋白，参与细胞增殖凋亡等生物学行为[17]。癌症的发生发展与HSF1密切相关，其可能在细胞的病变过程中被激活。相关研究表明，子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌组织中HSF1呈现显著的高表达[18]。研究中指出，M2型巨噬细胞参与癌细胞的血管生成、免疫抑制等，并且与癌细胞的增殖凋亡等密切相关，而甘露糖受体就为其细胞表面高表达CD206分子[19]。甘露糖受体与病原体的识别、吞噬、清除相关，sMR则由内源性细胞金属蛋白酶对膜结合形式的MR水解切割释放[20]。研究表明，肝炎患者血清sMR水平异常表达[21]。研究表明，miR-758-3p可通过靶向抑制MDM2和mTOR的表达降低肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，是肝癌治疗的潜在分子靶点[22]。所以本研究旨在探讨肝癌患者HSF1、sMR、miR-758-3p水平变化并分析其与临床病理特征的关系，为肝癌患者的临床诊断与治疗提供新思路。

本研究通过免疫组织化学法检测两组HSF1表达情况，结果显示，肝癌患者HSF1阳性表达显著高与对照组，这与肖亿等[22]在关于HSF1与肝癌组织中表达的研究中的实验结果相一致。这提示HSF1表达情况与肝癌的发生有着一定的联系，这可能与HSF1与凋亡信号通路中的关键蛋白和激酶互相作用一致肿瘤细胞凋亡有关[23-24]。本研究采用ELISA对两组血清sMR水平进行检测，结合研究结果与统计学分析结果可证实，肝癌患者血清中sMR的水平较慢性肝炎患者明显升高，提示在肝癌患者中sMR高表达，这可能是sMR在多种癌症中高表达，与癌细胞的转移有关[25]。本研究又采用RT-qPCR检测法来检测两组患者的miR-758-3p水平，分析结果与统计学结果发现，试验组研究对象体内miR-758-3p水平较对照组研究对象显著下降。

在本研究的最后分析了肝癌患者HSF1、sMR、miR-758-3p三个指标与性别、年龄、BMI等临床病理特征之间的联系，结果表明，HSF1、sMR、miR-758-3p表达水平与淋巴结转移、微血管侵犯、病理分期、AFP相关，其中伴有淋巴结转移、微血管侵犯、病理分期属于Ⅲ期、AFP≥400 μg/L的患者HSF1阳性例数比例相对较多、血清sMR表达水平相对较高、miR-758-3p水平相对较低。临床病理特征中淋巴结转移、微血管侵犯、病理分期、AFP等指标的情况可分析患者的病情进展，而通过结果可知，随着肝癌患者的病情进展，肝癌患者HSF1阳性表达增加，血清sMR表达水平增加，miR-758-3p表达水平降低，这对于疾病的严重程度及预后具有一定的预测价值。

本研究ROC分析结果显示，HSF1、sMR、miR-758-3p联合诊断肝癌的效能为1.000，高于单独HSF1、sMR、miR-758-3p诊断，说明联合检测肝癌患者HSF1、sMR、miR-758-3p水平能为肝癌的诊断提供更为可靠的依据，有助于疾病预防、诊断和治疗。

综上所述，将HSF1、sMR、miR-758-3p应用于肝癌的早期诊断与治疗中可发挥显著的优势。同时本研究也有部分不足，一方面是纳入研究的病例较少且来源局限，这就需要扩大病例来源，增加病例数量进行深入探索；另一方面，试验中存在不可避免地不可控因素，可能对试验结果的可信度存在影响，还需临床纳入更多病例进行试验以提高可信度并且实验可以纳入肝硬化、病毒性肝炎、脂肪肝等良性肝脏疾病人群与肝癌患者进行分析研究，为其应用于临床提供更加全面的理论与实验支持。