环状RNA circDYSF在不同类型冠心病患者外周血中的表达及临床价值探讨

赵静雯 于海奕 张永珍 高炜

冠心病严重威胁我国居民健康。目前，对于不同类型冠心病的区分主要依靠症状、心电图和心肌标志物，其在敏感性方面仍有一定局限。随着转录组学的发展，越来越多的研究发现环状RNA（circRNA）参与冠心病发生发展的病理过程。circRNA作为一种结构稳定的非编码RNA，具备生物标志物的良好特性，同时可结合微小RNA（miRNA）调控信使RNA（mRNA）的翻译而参与多种生物学过程，有望为冠心病的辅助诊断及分子机制研究提供依据［1-2］。本课题组前期通过高通量测序在冠心病患者外周血中检测到一类由Dysferlin基因编码的新型环状RNA circDYSF（find_circ_0039200）。本研究旨在探讨circDYSF在不同临床类型冠心病患者中的表达水平，及其与疾病和病变严重程度的相关性。

1 对象与方法

1. 1 研究对象

按照1∶1∶1匹配的原则前瞻性研究入组2018年8月至2020年6月在北京大学第三医院就诊的不同类型冠心病患者，包括慢性冠状动脉综合征（chronic coronary syndromes，CCS）、不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris，UAP）和ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）各50例。所有患者均接受了冠状动脉造影检查。以同期经临床和冠状动脉造影排除冠心病的患者43例为对照组。CCS诊断标准符合2019年欧洲心脏病学会指南［3］，UAP诊断符合2012年美国心脏协会治疗指南［4］，STEMI诊断标准符合2018年世界心脏联盟、美国心脏病学会、美国心脏协会和欧洲心脏病学会工作组第四版心肌梗死通用定义［5］。排除标准为纽约心脏病协会（New York Heart Association，NYHA）或Killip心功能分级Ⅲ～Ⅳ级、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤、甲状腺疾病、炎症性疾病及其他类型心脏病。对入组患者外周全血RNA进行高通量测序。本研究通过北京大学第三医院医学科学伦理委员会审查（批号：IRB00006761-M2017365）。所有研究对象均签署知情同意书。

1. 2 临床资料采集

收集患者性别、年龄、入院时心率、血压及既往病史，检测血常规及生化指标，包括糖化血红蛋白、肌酐、血脂水平及心肌损伤标志物［心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）和N末端B型脑钠肽前体（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）］等。STEMI患者入院每6 h检测心肌损伤标志物至达峰并记录其峰值。对所有患者经桡动脉或股动脉路径行冠状动脉造影检查，由两名介入医师阅读冠状动脉造影结果并评估病变狭窄程度。根据病变位置及狭窄程度计算Gensini评分，对冠状动脉病变的严重程度进行定量评估。Gensini评分等于所有狭窄段评分之和，各狭窄段评分为管腔狭窄程度所对应分数和狭窄位置所对应分数的乘积。

1. 3 光学相干断层成像（optical coherence tomography，OCT）检查

OCT检查应用C7XR系统以及Dragonfly成像导管（Lightlab Imaging/St. Jude Medical，美国）。将成像导管沿着导丝送到血管内病变远端，当OCT图像显示清晰时，以25 mm/s 自动回撤成像导管，扫描成像。由两名经验丰富的术者逐帧对斑块性质进行判定。所有靶病变性质均呈现不稳定斑块特征者即划分为不稳定斑块组，包括连续3帧测量纤维帽厚度＜85 μm，脂质池角度≥90°，伴或不伴有巨噬细胞浸润、新生血管及胆固醇结晶等；斑块致冠状动脉显著狭窄（程度≥75%）且呈现不稳定特征（如斑块破裂溃疡、血栓影等）。冠状动脉病变均不符合不稳定斑块特征者划分为稳定斑块组［6-9］。若患者血管病变合并稳定及不稳定两种性质斑块则不归为任何一组。

1. 4 高通量核酸测序

采集研究对象外周全血10 ml，加入Trizol试剂30 ml，剧烈震荡后室温孵育5 min。血标本于诺禾致源公司进行后续RNA提取、质检和定量、circRNA文库构建以及上机测序等。应用find_circ软件对circDYSF进行鉴定。

1. 5 富集分析

利用m i R a n d a数据库预测ci r cDYSF可能调控的靶基因。为了解circDYSF潜在的功能或影响的通路，对circDYSF所调控的靶基因应用KOBAS（http：//www.genome.jp/kegg/）网站进行京都基因与基因组大百科全书数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1. 6 统计学分析

所有数据采用SPSS 24.0统计软件进行处理。正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov法。正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。非正态分布的计量资料用中位数（四分位数间距）［M（Q1，Q3）］表示，两组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。计数资料用［例（%）］表示，组间比较采用卡方检验。正态分布连续变量单因素相关性分析应用Pearson相关性检验，非正态分布变量应用Spearman相关性检验。诊断效能的评价利用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线。采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 不同类型冠心病患者临床特征比较

各组患者的临床资料比较显示，STEMI组患者入院时心率、白细胞计数、空腹血糖、超敏C反应蛋白及心肌损伤标志物（cTnT、CK-MB和NTproBNP）均高于非心肌梗死患者（对照组、CCS组和UAP组），而左心室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）低于非心肌梗死患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。STEMI组患者三酰甘油水平高于对照组及UAP组患者，高密度脂蛋白胆固醇低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。四组患者在年龄、性别组成和既往病史等方面比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05，表1）。

表1 各组患者临床资料比较

2. 2 circDYSF在不同类型冠心病患者中的表达水平

比较对照组和不同类型冠心病患者外周血中circDYSF表达水平，结果显示circDYSF在冠心病患者中表达量（单位：transcripts per million，T P M）高于对照组［（36.2 2±18.4 4）T P M比（24.63±15.38）TPM，P=0.008］。其中circDYSF在STEMI组患者中最高［（40.65±25.62）TPM］，其次为UAP组［（31.40±14.81）TPM］和CCS组［（28.17±14.09）TPM］，三组患者比较，差异有统计学意义（P=0.031）。

2. 3 circDYSF与临床指标的相关性分析

冠心病患者外周血c i r c D Y S F 与c T n T（r=0.379，P＜0.0 01）、C K-M B（r=0.36 2，P＜0.001）及NT-proBNP（r=0.166，P=0.012）正相关，与LVEF负相关（r=-0.336，P＜0.001），见表2。

表2 circDYSF 与临床指标的相关性分析

2. 4 circDYSF与冠状动脉病变严重程度的相关性分析

对不同类型冠心病患者的冠状动脉造影结果进行分析：CCS组患者中单支病变26例（52.0%）、双支病变18例（36.0%）、三支病变6例（12.0%）；UAP组患者中左主干病变1例（2.0%）、单支病变24例（48.0%）、双支病变11例（22.0%）、三支病变14例（28.0%）；STEMI组患者中左主干病变1例（2.0%）、单支病变21例（42.0%）、双支病变13例（26.0%）、三支病变15例（30.0%）。三组患者冠状动脉病变Gensini评分分别为30.00（10.75，53.75）分、34.00（14.75，64.50）分和70.00（40.00，98.00）分，其中STEMI组患者Gensini评分均高于CCS组及UAP组患者，差异有统计学意义（均P＜0.001）。相关性分析显示，冠心病患者外周血circDYSF表达量与其Gensini评分呈正相关（r=0.287，P＜0.001）。

2. 5 circDYSF与斑块稳定性的相关性分析

对研究对象中行OCT检查的患者进行亚组分析，利用OCT判定病变特征，依据斑块性质将患者分为稳定斑块组10例及不稳定斑块组10例。稳定斑块组共检出病变16处，包括纤维斑块3处、钙化斑块5处、脂质斑块4处和混合斑块4处。不稳定斑块组检出脂质及富含脂质的混合斑块、破裂斑块共18处病变。circDYSF在不稳定斑块组表达水平高于稳定斑块组［48.62（39.02，74.68）TPM比29.32（20.89，45.65）TPM，P=0.043，图1］。ROC分析circDYSF识别不稳定斑块的曲线下面积为0.77（95%CI0.53～0.93，P=0.017），敏感度90.0%，特异度60.0%（图2）。

图1 circDYSF 在稳定斑块组及不稳定斑块组的表达量

图2 circDYSF 诊断不稳定斑块的受试者工作特征曲线

2. 6 circDYSF通路富集分析

本研究采用生物信息学预测c i r c D YS F可能调控的靶基因并进行K EGG通路富集分析。如图3显示，circDYSF所调控的基因显著富集于溶酶体途径、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信号通路、肾上腺素能信号转导通路、催产素信号通路和碱基剪切修复等。

图3 circDYSF 调控基因的KEGG 通路富集分析

3 讨论

我国冠心病现患人数逐年增加，已成为重大的公共卫生问题［10］。冠心病以动脉粥样硬化为病理生理基础，不同斑块性质决定冠心病的临床类型和治疗策略选择。探究不同类型冠心病的分子和病理机制，有助于为疾病诊治提供新的思路。近年来一些研究证实circRNA可能成为冠心病的新型分子标志物，也可以参与冠心病发生发展的多种病理过程，成为潜在的治疗靶点［11-12］。但circRNA是否有助于区分冠心病的不同亚型，与冠心病临床特征的相关性尚未见研究报道。本研究基于高通量测序数据，发现circDYSF在不同类型冠心病中存在差异， STEMI时表达量更高，且与心肌坏死标志物和冠状动脉病变评分正相关，提示circDYSF可能反映冠心病的严重程度。另外，circDYSF可能与斑块不稳定有关，并可通过溶酶体途径和AMPK信号通路等参与冠心病的病理过程。

既往circRNA与冠心病相关的研究仅将冠心病总体或其中某一亚型与对照组进行表达分析，未对circRNA在冠心病不同亚型中的表达情况进行探讨［13-14］。如Wang等［15］研究者经微阵列分析发现冠心病患者外周血中hsa_circ_0001879 和hsa_circ_0004104表达上调，ROC曲线下面积分别为0.703和0.700，可能作为冠心病的生物标志物。有研究通过比较急性心肌梗死患者及对照组发现，circPostn及circMICRA可有助于急性心肌梗死的诊断［16］。本研究显示circDYSF在CCS组、UAP组和STEMI组间表达水平逐渐升高，可能反映冠心病的不同类型并有助于评估其临床严重程度。冠心病主要包括急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）和CCS两种类型，ACS和CCS之间以是否发生斑块破裂、侵蚀、钙化结节伴或不伴急性血栓形成等冠状动脉事件进行界定，展现了疾病的动态变化过程［17-18］。研究circDYSF在不同类型冠心病中的表达水平，有助于探索冠心病进展的分子机制。

本研究发现circDYSF与CK-MB和cTnT相关，表明circDYSF有望作为冠心病的候选生物标志物，并反映心肌坏死程度。Gensini评分是临床常用的冠状动脉病变严重程度的评价标准，用于指导介入策略选择［19］。circDYSF与Gensini评分的相关性提示其有助于冠状动脉病变严重程度评估。本研究结果显示circDYSF在临床和冠状动脉病变两个层面均可反映冠心病的严重程度。

本研究发现circDYSF在合并冠状动脉不稳定斑块患者外周血中表达增加。不稳定斑块与主要不良心血管事件的发生密切相关，识别不稳定斑块有助于冠心病危险分层及治疗策略选择［20］。OCT是目前区分斑块类型和特征的精准手段，但操作复杂、价格昂贵［21］。探索无创简便的循环标志物以鉴别不同斑块类型是目前的研究热点。目前尚未发现circRNA与冠状动脉斑块性质的相关研究，本研究发现circDYSF不仅有助于临床分型，对斑块性质可能也具有一定的区分价值，有待扩大样本量进一步证实。

通路富集分析显示，c i r c D Y S F 可能通过溶酶体途径和A M P K 信号通路等参与冠心病的病理生理过程。低密度脂蛋白（low densit y lipoprotein，LDL）氧化是动脉粥样硬化的关键环节，LDL可在巨噬细胞的溶酶体内被氧化进而参与冠心病发展［22］。与本研究富集分析结果相似，有学者发现颈动脉内膜的稳定及不稳定斑块组织中差异表达的基因显著富集于溶酶体通路中［23］。研究表明，AMPK信号通路在动脉粥样硬化的发病机制中具有重要作用［24］。Chen等［25］研究者发现，载脂蛋白E敲除小鼠的AMPK-PPARα通路激活后促进巨噬细胞由M1向M2型转化，增加动脉粥样硬化斑块稳定性。Ding等［26］研究表明，AMPK异构体AMPKα2抑制血管平滑肌细胞表型转换并增强晚期动脉粥样硬化斑块稳定性。同样，AMPKmTOR-自噬信号激活亦可抑制动脉粥样硬化的发展［27］。另外，AMPK可能作为动脉粥样硬化过程的炎症抑制因子［28］。巨噬细胞极化、血管平滑肌细胞表型转化、炎症反应和细胞自噬等，是不稳定斑块形成的病理基础。研究表明，AMPK信号通路参与不稳定斑块形成的多个病理阶段。这也与本研究发现的circDYSF在具有不同性质斑块的患者中表达存在差异的结果相符合。通路富集分析结果提示circDYSF可能成为冠心病的潜在治疗靶点。

本研究存在一定局限性：纳入样本量较少可能会导致所得结果存在偏倚。研究中行OCT的患者仅对靶血管进行扫描，非靶血管可能存在不同性质的斑块而影响分析结论。未能进一步监测circDYSF的变化趋势。本研究发现circDYSF在不同类型冠心病中存在差异，STEMI时表达量更高；circDYSF与斑块不稳定有关，可能有助于不同类型冠心病的鉴别诊断。未来将进一步扩大样本量对circDYSF的表达量进行验证，并开展基础实验以探索其具体作用和机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突