北京市朝阳区宠物（鸽鸟）鹦鹉热衣原体病流行病学调查

唐艳荣，张小梅，张海云★，王雅琴，张雪梅，曹院章，杨秀环

（1.北京朝阳区动植物疫病预防控制中心，北京 100018；2.北京市动物疫病预防控制中心，北京 102609）

鹦鹉热衣原体病是一种严格真核细胞内寄生的人兽共患病病原体，最先从鹦鹉体内被分离出来，是一种在众多宿主动物中广泛传播的病原微生物，可以引起人类、家禽、野生禽类、宠物感染和传播。鹦鹉热衣原体禽类感染后呈严重的呼吸道疾病、消化道疾病和生产性能的降低，由于其部分感染状态呈隐性感染,对禽类养殖业会造成长期性危害和损失。人感染后典型临床表现为高热、恶寒、头痛、肌痛、咳嗽和肺部浸润性病变等特征。一般症状颇似感冒或呼吸道感染，但多见于发生肺炎。据不完全统计，俄罗斯每年由衣原体引起的急性肺炎发病率为14.9%，而在美国由鹦鹉热衣原体引起的人类肺炎为20%。据Meyer调查，1931～1963年间世界范围内因接触家禽而发生的人类鹦鹉热衣原体病为5390例。据CDC公布数据，从1988～1998年间，大约有813人死于鹦鹉热衣原体感染。

目前朝阳区饲养宠物鸟、鸽子等约15万只，且是野生鸟类的重要栖息地，存在感染人兽共患鹦鹉热衣原体病风险。本课题组于2020年引进LAMP核酸快速检测技术，该技术基于病原DNA恒温扩增的原理，使用简易的恒温设备和试剂，30min可以根据反应显色差异达到快速诊断的目的，降低了实验开展的条件，让基层单位开展宠物疫病的快速诊断变成现实。通过此方法对朝阳区进行鹦鹉热衣原体病流行病学调查，为北京地区鹦鹉热衣原体病疫情分析、预警和防控策略奠定了基础，对公共卫生安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂衣原体IHA诊断试剂盒：中国农业科学院兰州兽医研究所研制，批号20200928204；鹦鹉热衣原体（LAMP）核酸检测试剂盒：北京肽诺生物科技有限公司研制。

1.2 样品种类和来源2020年5月～2020年12月，课题组在北京市朝阳区不同方位选取信鸽运动协会、某肉鸽养殖场、北京会仪中心、朝阳区3家宠物诊疗机构，随机采集样本的方式，共采集血清200份；EDTA血液和咽肛拭子共计750份，其中信鸽血液39份；信鸽拭子39份；肉鸽血液428份；野禽血液20份；野禽拭子24份；犬血液44份；犬拭子44份；猫血液56份；猫拭子56份。

1.3 主要仪器设备MiniH100恒温金属浴：3台，采购于大龙兴创；迷你离心机：1台，移液器：10μL、200μL采购于热电公司。

1.4 方法

1.4.1 血清学（IHA）抗体检测方法

1.4.1.1 操作步骤

（1）铺板 每孔加稀释液0.075mL。

（2）稀释血清 用移液器吸取被检血清0.025mL加入第1孔，呈4倍递增稀释3孔（即1:4～1：64）。第3孔弃去0.025mL，孔内液体量仍为0.075mL。同一班上同时设阳性、阴性和空白对照各2孔。

（3）加抗原每孔内加稀释液好的抗原0.025mL，置微型震荡器上振荡2min，盖上玻璃版在37℃作用2h判定结果。

1.4.1.2 结果判定对照各孔均成立，则被检血清1:16孔出现“++”以上者为阳性；1:4孔出现“+”以下者为阴性；1:4孔出现“++”至1:16孔“+”以下者为可疑。

1.4.2 病原学（LAMP）核酸检测方法本试剂适用于检测疑似患者痰液或盥洗以及咽拭子等和疑似动物（鸟类、宠物等哺乳动物）EDTA抗凝血、肺脏、肝脏、淋巴结等组织中的鹦鹉热衣原体DNA，用于鹦鹉热衣原体感染的辅助诊断及流行病学调查，其检测结果仅供科研研究和参考。

1.4.2.1 引物设计从NCBI数据库下载鹦鹉热衣原体ompA基因全长，这些序列（AF269281.1、X56980.1、Y16561.1、AF169265.1、L25436.1、AF2692 66.1、EF375557.1、X12647.1AY762613.1、EU159263.1、AB284062.1、AF269259.1、AF269268.1、AF269269.1、EF028916.1、EF197820.1、AB284058.1、AJ243525.1、AB284065.1、AB284064.1）包含A-F、E/B、M56和WC等9种常见的基因型,使用ClastW在线比对工具选取保守序列251bp，并以此序列为模板在线设计（http://primerexplorer.jp/e/）LAMP引物组。可以检测包括基因型A、B、C、D、E、F、E/B、M56、WC 9种鹦鹉热衣原体。

1.4.2.2 试验方法和步骤

（1）取样及前处理 用无菌咽拭子拭取咽部分泌物，将分泌物或咽拭子置于无菌离心管，加入30～50μL样本裂解液，置于金属浴上95℃加热7min，加热完毕后可适当离心，上清液备用。

表1 保守模板及LAMP引物组序列

（2）试剂分装和反应 从8连PCR管上剪取所需检测数量的管子，分别在每个管子中加入24μL复溶液，同时加入1μL上步骤待用的上清液，之后轻轻将30μL矿物油加到每个PCR管子中，此时可看到管子中有分层的液体。完毕后扣上盖子置于金属浴中63℃加热30min，严禁超时。

1.4.2.3 结果判读30min后，将反应管取出并倒置并轻轻颠倒，待管盖上橙红色染料溶解后可观察液体颜色；液体颜色显示黄绿色的为鹦鹉热衣原体阳性，液体颜色显示橙黄色的为鹦鹉热衣原体阴性。

2 结果

2.1 血清学（IHA）抗体检测结果对200份犬猫、肉鸽、野禽的血清样品进行的IHA抗体检测，结果为阳性样品30份，阳性率为15%。

2.2 IHA方法检出的阳性血清对应的EDTA血液样品、咽肛拭子的样品，用LAMP核酸病原学检测。

对IHA检测出的30分阳性血清所对应的30份EDTA血液、咽肛拭子的样本经LAMP核酸检测，共检出30份阳性样品。IHA检出样品的阳性率为15.0%，结果见表2。

表2 宠物（鸽鸟）鹦鹉热衣原体血清学（IHA）抗体检测调查结果

2.3 病原学（LAMP）核酸检测结果通过LAMP核酸快速检测技术和标准方法（IHA）的结果比较，从而进一步判断该方法的可靠性，应用LAMP核酸检测方法检测朝阳区宠物犬猫、鸽子、野禽样本共计750份，阳性率13.87%。结果统计见表2和统计图1。

图1 宠物（鸽鸟）各种样本鹦鹉热衣原体病原学检测结果图

3 讨论

通过IHA和LAMP检测方法对北京市朝阳区的宠物、鸽鸟200份血清，750份血液和咽肛拭子样品的检测结果，发现阳性率高达15%左右，远高于我国1987～1989年全国鹦鹉热衣原体阳性率的10.96%。表明本市朝阳区地区，有宠物、鸽鸟鹦鹉热衣原体感染情况。本次采集的各种样品涵盖了宠物犬、猫、信鸽、肉鸽、野生禽类等。发现各种环境下的鹦鹉热衣原体阳性感染率区别不大，都呈现一定的感染率，表明了鹦鹉热衣原体在北京地区宠物、鸽鸟中的整体流行性。

表3 宠物（鸽鸟）鹦鹉热衣原体病原学检测调查结果

宠物、鸽鸟和人类接触紧密，人被感染的情况也时有发生。根据美国一项研究揭示，当禽衣原体病的流行率达到60%时，30%养有病鸟的家庭成员会感染上该病。因此，鹦鹉热衣原体对北京地区居民健康也具有相当大的威胁。有必要对与宠物、鸽鸟类接触紧密的人员及其家庭成员做进一步的鹦鹉热衣原体的检测，特别是有可疑症状的人员，非常有必要加强监控。

鉴于北京地区宠物、信鸽、肉鸽、野禽已经出现鹦鹉热衣原体的流行，建议采取如下措施来阻断其发生和流行。首先，加强进口信鸽的检疫，严防鹦鹉热衣原体从国外进口到国内群体；其次，对高密度饲养的信鸽、肉鸽进行鹦鹉热衣原体疫苗免疫，阻断其再次感染；再次，建议农业部强化对禽用弱毒、冻干疫苗质量的监督，防治鹦鹉热衣原体污染疫苗，切断向健康群体传播。