天麻酚性成分组合物减轻LPS刺激致BV2细胞炎症模型的影响

聂发龙，郑俭彬，朱紫陌，向 彬，李秀芳

(云南中医药大学，云南 昆明 650500)

脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI)是严重威胁老年人健康的疾病，其具有高发病率和高死亡率的特点，是全球医学界面临的挑战[1]。CIRI的病理机制较为复杂，包括神经炎症[2]、钙稳态失调[3]、兴奋性毒性[4-5]、神经元凋亡和坏死[4，6-7]。其中，神经炎症反应与脑缺血后神经继发性损伤的有着重要联系，持续的神经炎症会诱发一系列信号级联反应。小胶质细胞异常活化介导的炎症是CIRI的关键病理机制。因此，减轻小胶质细胞炎症反应可能是CIRI治疗的有效途径之一[8-9]。有研究表明[10]，天麻多个酚性成分对异常活化小胶质细胞具有很好的抗炎作用，这些酚性成分可通过抑制NF-κB 信号通路和 LPS 刺激的小胶质细胞中MAPK的磷酸化，显著减轻神经毒性，具有作为神经退行性疾病的抗炎候选药物的潜力[11]。课题组前期将4个具有抗CIRI活性的天麻酚性成分对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、3，4-二羟基苯甲醛、4-甲氧基苄醇采用均匀设计的方法，筛选得到了具有较高活性的抗CIRI、抗血小板聚集及抗动脉粥样硬化作用的活性成分组合物(下文简称：组合物)。本实验采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激BV2小胶质细胞炎症模型，对该组合物对神经炎症的影响进行了考察，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验细胞 小鼠小胶质细胞株BV-2细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。昆明细胞库(KCB)编号：KCB200770YJ。

1.1.2 实验药品和试剂 RPMI Medium 1640(1X)(美国Gibco，REF：11875-093)、脂多糖(Lipopoiysaccharides，LPS)(美国Sigma，L2880)、胎牛血清(FBS)(美国Gibco，REF：10099-141)、青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin)(美国Invitrogen，REF：15140-122)、一氧化氮(NO)一步法测试盒(REF：A013-2)、小鼠IL-6 ELISA试剂盒(REF：201603031)、IL-10(REF：201603031)、IL-1β(REF：201603031)、TNF-α(REF：201603031)、PGE2(REF：201603031)均购买于南京建成生物工程研究所。Anti-Mannose Receptor antibody(abcam，Lot：GR248262-7)、Anti-CD16+CD32 antibody(FITC)(bcam，Lot：GR276159-1)、aPE Rat Anti-Mouse IgG1(BD Biosciences，Lot：5310917)。天麻酚性成分组合物(含对羟基苯甲醛0.023 mg/mL、对羟基苯甲醇0.031 mg/mL、4-甲氧基苄醇0.021 mg/mL、3，4-二羟基苯甲醛0.19 mg/mL)，IL-4(美国Sigma，0309AFC49)、阳性对照药米诺环素(Minocycline hydrochloride)(美国Sigma，M9511)。

1.1.3 实验仪器 CO2细胞培养箱(311)(美国 Thermo scientific 公司)、倒置显微镜(Ti-S)(日本Nikon公司)、分析天平(XS125A)(瑞士普利赛斯)、酶标仪(Infinite M200 PRO)(瑞士Tecan公司)、低温高速离心机(cf16RX)(Hitachi Koki公司)、高压蒸汽灭菌器(SN310C)(日本 Yamato 公司)、电子分析天平(AB204-S)(瑞士Mettler toledo公司)、数显恒温水浴锅(HH-S24)(金坛市大地自动化仪器厂)、流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 组合物对BV-2细胞增殖的影响 取对数生长期的BV-2细胞，计数并调整细胞密度为1×104个/mL，接种于96孔培养板，每孔180 μL。继续正常培养细胞2 d，第3 d用不完全培养基饥饿处理1 d，第4 d加入不同浓度的含药且不含血清的培养基，实验细胞设为空白组(只加培养基)、正常组、阳性对照组、组合物组，每组设置6个复孔，将96孔培养板放入37 ℃，5%CO2条件下培养24h，每孔中加入MTS溶液36 μL，放入培养箱孵育2 h后，选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度(以OD值表示)，计算细胞相对存活率，计算公式如下：

细胞存活率(%)=[(实验组OD值-空白组OD值)/(正常组OD值-空白组OD值)]×100%

1.2.2 组合物对 LPS刺激致BV-2细胞炎症模型的影响 取对数生长期的BV-2细胞，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于6孔培养板，每孔2 mL。实验细胞设为正常组、LPS组(1μg/mL)、阳性对照组、组合物+LPS组，继续正常培养细胞2天，第3 d用无血清培养基饥饿1 d，第4 d正常组和LPS组加入不完全培养基，阳性对照组加入不完全培养基配置的1 μmol/L米诺环素，组合物组加入不完全培养基配置的组合物(10、1、0.1μg/mL)，继续培养24 h，模型组、阳性对照组、组合物组均给予1 μg/mL的LPS刺激，正常组给予等量的PBS，24 h后，收集细胞上清液，按照NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2和IL-10的ELISA试剂盒说明书步骤操作，测定OD值，计算细胞上清液中的NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2和IL-10的含量。

1.2.3 组合物对LPS刺激BV-2细胞膜蛋白CD16/32、CD206表达的影响 取对数生长期的BV-2细胞，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于6孔培养板，每孔2 mL。实验细胞设为正常组、LPS组(1 μg/mL)、阳性对照组(1 μmol/L的米诺环素)、IL-4组(10 ng/mL)、组合物组(10、1、0.1、0.01 μg/mL)。继续正常培养细胞2 d，第3 d用无血清培养基饥饿处理，第4 d正常组和LPS组加入不完全培养基培养，阳性对照组、IL-4组、组合物组分别加入不含血清培养基配置的各组浓度的药物，继续培养24 h，LPS组、IL-4组、阳性对照组、组合物组均给予1 μg/mL的LPS刺激，正常组给予等量的PBS，24 h后，流式细胞仪检测膜蛋白CD16/32、CD206表达。调整各组细胞浓度调为1×106个/mL。膜蛋白CD16/32采用细胞表面直接免疫荧光染色方法检测，膜蛋白CD206采用细胞表面间接免疫荧光染色法检测。

2 实验结果

2.1 组合物对BV-2细胞增殖的影响 结果显示，组合物在0.001～100 μg/mL浓度范围内作用于BV-2细胞 24 h对 BV-2细胞增殖无明显影响。详见表1。

表1 组合物对BV-2细胞存活率的影响

2.2 组合物对LPS刺激致BV-2细胞炎症模型的影响 结果显示，1 μg/mL LPS刺激BV2细胞后，细胞上清中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的含量均比正常组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，提示模型复制成功；米诺环素组、组合物高浓度组均能明显减少LPS刺激BV-2细胞释放NO、TNF-α、IL-6、PGE2的含量(P<0.05或P<0.01)；LPS刺激后，IL-10含量有下降趋势，给予组合物1 μg/mL、0.5 μg/mL可促进IL-10的释放。详见表2。

表2 组合物对LPS刺激BV-2细胞释放NO、TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、IL-10的影响

2.3 组合物对LPS刺激BV-2细胞活化后细胞膜蛋白CD16/32、CD206表达的影响 结果显示，与正常组比较，LPS组的膜蛋白CD16/32、CD206、CD206/CD16/32的表达均无明显变化，与模型组比较，10 ng/mL的IL-4和1 μmol/L的米诺环素均能下调膜蛋白CD16/32的表达(P<0.01)和上调膜蛋白CD206、CD206/CD16/32的表达(P<0.01)，10、1、0.1、0.01 μmol/L的组合物均能下调膜蛋白CD16/32的表达(P<0.01)，1、0.1、0.01 μmol/L的组合物均能上调膜蛋白CD206、CD206/CD16/32的表达(P<0.01)。详见表3、图1。

表3 组合物对LPS诱导BV-2细胞活化后膜蛋白CD16/32、CD206表达的影响

图1 组合物对LPS诱导BV-2细胞活化后膜蛋白CD16/32、CD206表达的影响

3 讨论

近年来的植物化学和药理研究共同表明，中药及其复方的药效往往不是由单一的活性成分来发挥，而是多种活性成分综合效应的结果。“组分中药”概念的提出，简化了中药的多成分论，为研究中药复杂的药效物质基础提供了新的思路和方法[12]。组分中药的有效性具有大量临床应用背景作为依据，并且在对有效成分的组合配比筛选过程中，加强了对特定病症的针对性活性筛选，进一步为组分中药后续的药效学成药性及安全性成药性研究奠定了基础[13]。课题组前期的研究显示，天麻及其多个活性成分具有较好的抗CIRI作用，在组分中药研究思路的指导下，采用均匀设计的方法，对天麻4个酚性成分对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、3，4-二羟基苯甲醛、4-甲氧基苄醇抗CIRI活性进行了优化筛选，得到的组合物除具有明显抗CIRI活性外，还具有显著的抗血小板聚集、抗血栓形成及抗动脉粥样硬化作用[14]。但对组合物是否具有减轻CIRI后神经炎症作用尚不清楚，故进行了本实验的研究。

神经炎症是CIRI疾病发展中一个重要且不可避免的病理过程[15]，减轻CIRI后的神经炎症是改善预后的重要途径之一。小胶质细胞是介导CIRI后神经炎症的主要细胞类型。本实验采用LPS刺激致BV2小胶质细胞炎症模型为研究对象，对组合物的作用进行了考察，结果显示采用1μg/mL浓度的LPS刺激BV-2细胞24h可成功复制BV2细胞炎症模型。

正常情况下，高度分枝状静息状态的小胶质细胞为大脑提供了一个高度动态和高效的监测系统，当脑内发生炎症、感染、创伤或其他神经系统疾病时，小胶质细胞迅速被激活并获得吞噬功能。具有不同表型的活化小胶质细胞是缺血性卒中的双刃剑[16-18]。当免疫稳态被破坏时，小胶质细胞的表型可以转变为两个极端：经典激活的M1(促炎)表型和交替激活的M2(抗炎)表型。不同的小胶质细胞表型在调节炎症性疾病的发生、发展和停止中起着重要作用。因此，与单纯抑制M1激活相比，抑制M1表型同时刺激M2表型被认为是治疗神经炎性疾病的一种潜在的治疗方法[19-20]。本实验的结果显示，组合物(10μg/mL)能明显减少LPS刺激BV-2细胞释放NO、TNF-α、IL-6、PGE2的含量(P<0.05，P<0.01)；促进抗炎因子IL-10释放，下调M1型BV2小胶质细胞膜蛋白CD16/32的表达(P<0.01)和上调M2型小胶质细胞膜蛋白CD206表达，并提高CD206/CD16/32的比值(P<0.01)。以上结果表明，组合物具有明显减轻LPS刺激导致的BV2细胞炎症反应，其作用途径可能与抑制促炎的M1型小胶质细胞转化为抗炎的M2型小胶质细胞有关。天麻4个酚性成分的组合物具有作为减轻CIRI后神经炎症药物开发的潜力，其促进小胶质细胞从M1型向M2型转变的深入机制有待进一步研究。