铁死亡及其与新生儿缺氧缺血性脑病的关系

2023-01-04双丽燕张丽梅黄志华江丽霞

赣南医学院学报 2022年7期

双丽燕，张丽梅，黄志华，江丽霞

（1.赣南医学院2020级硕士研究生；2.赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室；3.赣南医学院基础医学院；4.赣南医学院第一附属医院，江西赣州 341000）

细胞死亡对维持机体动态平衡及发育是不可或缺的，也与各种疾病的发生、发展和预后密切相关。在哺乳动物中发现多种细胞死亡方式如坏死、凋亡、自噬及焦亡等，但这些都不能够充分解释细胞的死亡［1］。铁死亡是近些年来确认的不同于坏死、凋亡、自噬、焦亡的细胞死亡方式，有独特的形态、生化和遗传特性［2］，其主要特征包括：活性氧水平的提升、细胞内谷胱甘肽过氧化物酶4的减少、脂质过氧化物的积累和铁代谢异常等［3］。研究表明，铁死亡不仅在肿瘤中起重要作用，还与缺血/再灌注损伤及神经系统疾病有密切联系［4］。铁死亡也发生在缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）实验动物模型的海马组织中［5］，但研究仍处于初步阶段。因此，探究铁死亡的特点和机制是推进相关研究的助力。

1 铁死亡的概念和特点

铁死亡是一种铁依赖的、区别于其他细胞死亡方式的新型调节性细胞死亡［6］，其受到包括谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶4等在内的抗氧化系统的严密调控［7］。当抗氧化系统发生障碍时，可致脂质过氧化物的异常积累，引起铁死亡。Erastin是铁死亡的重要诱导剂，最早是在筛选抗肿瘤药物中发现的，对铁死亡的发现具有极其重要的意义，它可以选择性地作用于表达致癌基因Ras的肿瘤细胞，并使之死亡，而Erastin诱导的细胞死亡在形态、生化和遗传水平上与其他细胞死亡方式显著不同，并且使用铁螯合剂可抑制这种细胞死亡，因此，将这种细胞死亡方式确定为铁死亡［8］。铁死亡与其他细胞死亡方式的显著区别在于线粒体变小、膜密度浓缩、嵴减少或消失［8］，并且针对其他细胞死亡的小分子抑制剂对铁死亡诱导的细胞死亡不发挥作用，而抗氧化剂和铁螯合剂却能阻止这种细胞死亡［1］。

2 铁死亡的发生机制

铁死亡是近几年新发现的细胞死亡方式，相关机制研究还不完全清楚，目前研究认为，主要与谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、胱氨酸-谷氨酸逆向转运体（System Xc-）、p53、线粒体电压依赖性阴离子通道、自噬、铁代谢等有关。

2.1 GPX4与铁死亡GPX4是哺乳动物中8种谷胱甘肽过氧化物酶之一，也是唯一能够减少酯化的氧化脂肪酸和胆固醇氢过氧化物的酶［9］，谷胱甘肽是其主要的底物。在生理条件下，GPX4可将脂质过氧化物还原为脂醇，以保护细胞免受氧化应激的损害［10］，当使用小干扰RNAs对HT-1080细胞的GPX4基因敲减后，可导致脂质代谢产物的累积及细胞死亡［11］，因此，GPX4在铁死亡中起关键作用。通过影响GPX4合成或活性可以介导铁死亡。

一方面，通过抑制System Xc-活性，间接降低GPX4活性，从而介导铁死亡。由于System Xc-是介导细胞表面胱氨酸和谷氨酸交换的转运蛋白［12］，因此Erastin、sorafenib等作为System Xc-的抑制剂，可通过直接抑制System Xc-的活性，降低谷胱甘肽的合成，从而降低GPX4活性，增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，引起铁死亡［13］。另一方面，也可通过直接抑制GPX4的活性而介导铁死亡。例如，研究筛选鉴定的一种新型Ras选择性致死小分子（ras-selective-lethal compound，RSL），已知其至少有两种表型，即RSL3和RSL5，与Erastin诱导的铁死亡具有一些共同特征，都能够引起ROS水平升高。其中RSL3不需要通过System Xc-，而是直接作用于GPX4使其失活，导致ROS水平升高，引起铁死亡［14］。RSL5则不作用于GPX4，而是通过其他途径诱导铁死亡［15］。除RSL家族小分子能诱导铁死亡外，研究还发现，FIN（ferroptosis inducing）化合物如DPI7、DPI10、DPI12等也可诱导铁死亡，且大部分FIN化合物都是直接通过调节GPX4的活性诱导铁死亡［15］。

此外，通过影响GPX4的合成也可介导铁死亡。GPX4是一种硒蛋白，甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）途径是合成硒蛋白的重要途径［14］，经MVA途径合成GPX4需要硒代半胱氨酸tRNA转录子，当硒代半胱氨酸tRNA的成熟受阻时，将抑制硒蛋白GPX4的合成。因此，抑制MVA途径可使硒代半胱氨酸tRNA成熟受阻，影响GPX4的合成［11，16］，从而影响铁死亡。

综上所述，GPX4是影响铁死亡的关键物质，直接或间接地抑制GPX4的合成或活性，引起活性氧的积累，最终引起铁死亡。

2.2 System Xc-与铁死亡System Xc-是由轻链xCT（SLC7A11）和重链4F2（SLC3A2）组成，介导细胞外胱氨酸和细胞内谷氨酸进行1∶1交换的转运蛋白［12，17］，也是合成谷胱甘肽（glutathione，GSH）所必需的［13］。研究表明，System Xc-的抑制剂如Erastin可通过抑制System Xc-的活性，降低谷胱甘肽合成，从而降低GPX4活性，增加ROS水平，引起铁死亡［13］。谷胱甘肽和半胱氨酸是System Xc-介导铁死亡的两种重要物质。谷胱甘肽是细胞内主要的内源性还原剂［12］，半胱氨酸是谷胱甘肽合成的辅助物质。若谷胱甘肽缺乏，半胱氨酸摄取阻断或合成减少，可诱导氧化应激，导致铁死亡［18］。HAYANO M等［19］通过全基因组siRNA筛选确认了一种因子——半胱氨酰-tRNA合成酶（cysteinyl-tRNA synthetase，CARS），经证实，CARS的缺失可诱导转硫途径，促进半胱氨酸的合成，从而抑制铁死亡，因而通过敲除CARS基因可以抑制Erastin引起的铁死亡。

此外，抑制System Xc-功能还可上调内质网应激反应相关基因——阳离子转运调节蛋白1（cation transport regulator-like protein 1，CHAC1）的转录，导致内质网应激，由此推断，内质网应激可能参与了铁死亡［17］。总之，抑制System Xc-可引起胱氨酸摄取障碍，导致谷胱甘肽耗竭，从而降低GPX4的活性，提升脂质活性氧的水平，导致细胞铁死亡。

2.3 p53与铁死亡p53是一种控制细胞增殖和凋亡的肿瘤抑制转录因子［20］，可以通过控制或消除潜在的危险细胞来维持机体的动态平衡，因此在抗肿瘤方面发挥着重要的功能。一方面，p53可以通过降低细胞内活性氧的水平防止氧化应激诱导的细胞损伤和死亡；另一方面，高水平的应激或损伤导致p53的激活，从而诱导细胞死亡［21］。目前认为，p53主要是通过在转录水平上影响多种下游分子的表达进而调节铁死亡，其中与之密切相关的下游分子包括胱氨酸/谷氨酸转运蛋白-溶质载体家族7成员11（solute carrier family7 member11，SLC7A11）和精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1（spermine N1-acetyltransferase 1，SAT1）。

SLC7A11基因是p53介导的转录抑制靶点，研究发现p53通过抑制系统Xc-的关键成分SLC7A11的表达，减少胱氨酸摄取，降低GPX4的合成，从而诱导铁死亡［22］。p533KR是p53中有三个赖氨酸突变（K117/161/162R）的乙酰化缺陷突变体，虽然缺失了p53的常规功能如细胞周期的停滞、凋亡等，但在ROS诱导条件下，依然可以抑制SLC7A11表达从而诱导铁死亡［22］。而SAT1基因作为p53转录新靶标，在多胺分解代谢中扮演重要角色，参与调节细胞的生长、增殖和分化［23］。研究显示，SAT1参与p53诱导的铁死亡依赖一种催化花生四烯酸过氧化的脂氧合酶（arachidonate 15-lipoxygenase，ALOX15），它独立于SLC7A11或在其下游发挥作用，也不调节GPX4的表达水平，研究显示，SAT1可增加ALOX15的表达，导致脂质过氧化，诱发铁死亡，而ALOX15抑制剂也可完全逆转SAT1诱导的铁死亡［24］。近年来，随着研究深入，又发现许多p53的靶点如细胞色素c氧化酶2、谷氨酰胺酶2等，p53可以在转录水平上抑制这些靶基因的表达，从而介导铁死亡［25］。

值得注意的是，p53在介导铁死亡中起双重作用，在对人结直肠癌的研究中发现，由Erastin诱导的铁死亡中p53可以与二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）形成复合物，阻断DPP4的活性，进入核内调节SLC7A11的表达，从而抑制铁死亡；p53缺失时，DPP4可以与NADPH氧化酶1（NADPH oxidase 1，NOX1）形成复合物，增加脂质活性氧水平，从而促进铁死亡［26］。总之，p53可通过多种下游靶基因的转录，在不同病理模型中对铁死亡发挥着不同作用。

2.4 线粒体电压依赖性阴离子通道与铁死亡线粒体电压门控通道（voltage-dependent anion channels，VDAC）负责线粒体外膜大部分代谢物及离子跨膜转运［27］。VDAC有三种异构体，分别为VDAC1、VDAC2和VDAC3。通过亲和纯化和质谱分析发现Erastin可以通过调节VDAC发挥作用，进一步使用放射性标记的类似物和过滤结合实验，证实了Erastin与VDAC2直接结合；通过分别敲低VDAC2和VDAC3基因，研究它们在细胞对Erastin的敏感性中发现，敲低VDAC3比敲低VDAC2细胞对Erastin更加敏感；但相比之下，若仅升高VDAC3的表达并不增加细胞对Erastin的敏感性［28］。此外，用siRNA研究各亚型在HepG2人肝癌细胞线粒体代谢中的作用，结果表明，游离微管蛋白可以抑制VDAC1和VDAC2，但不抑制VDAC3［29］，Erastin可通过介导微管蛋白-VDAC相互作用，影响线粒体外膜的通透性，引起非凋亡细胞死亡［28］。另外，研究发现，RSL5与Erastin一样可通过调节VDAC，激活氧化、非凋亡细胞死亡途径［14］。因此，结合铁死亡细胞中线粒体形态结构的改变，VDACs作为Erastin和RSL5的潜在靶标可能参与了铁死亡。

2.5 自噬与铁死亡自噬可以维持机体的内稳态，应对环境应激从而保护细胞，然而，过度的自噬可引起细胞死亡［30］。自噬还可调节细胞铁稳态和细胞内活性氧的产生，因此在调节铁死亡中起着重要作用［31］。研究发现，自噬相关基因（autophagyrelated genes，ATG）在介导自噬过程中起到关键作用，其中ATG5和ATG7促进自噬小体的形成。研究认为，ATG5介导的自噬是铁蛋白降解所必需的［30］。一方面，铁蛋白是细胞内主要的铁储存库，吞噬铁蛋白向溶酶体运送需要核受体共激活因子4（nuclear receptor coactivator-4，NCOA4）。当NCOA4缺乏时，细胞不能有效降解铁蛋白，因而引起细胞内铁的减少［32］，提示通过NCOA4介导的自噬途径吞噬铁蛋白，引起铁的释放，可以增加细胞内活性铁的水平，从而促进细胞内活性氧的快速积累，导致铁死亡的发生［33］。此外，转铁蛋白作为一种与铁结合的血浆蛋白，可以控制细胞内的铁水平。有相关研究报道，自噬也能通过诱导转铁蛋白受体1的表达而导致铁死亡［33］。因此，进一步研究自噬在铁死亡中的作用可能为今后的相关疾病研究提供新的思路。

2.6 铁代谢异常与铁死亡铁是一种以二价态存在活细胞内至关重要的微量元素［34］，是维持机体生命所必需的，包括氧运输、DNA合成、红细胞生成和ATP的产生等。然而，二价铁也具有氧化还原活性，过多时可产生活性氧，导致氧化应激，从而引起细胞死亡［35］。在生理条件下，机体通过严格的代谢系统以维持铁稳态。铁代谢过程主要涉及铁蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体及一些新发现的铁代谢调节蛋白等。早期研究发现，当氨基酸缺乏时，可以诱导小鼠胚胎成纤维细胞铁死亡，同时证实了诱发铁死亡需要谷氨酰胺和谷氨酰胺溶解及转铁蛋白的作用［36］。

近年来随着研究的深入，在有关铁代谢方面取得了突破性的进展。在遗传性血色病小鼠肝细胞中，抑制金属转运蛋白——溶质载体家族成员14（solute carrier family member 14，SLC39A14）编码基因的表达显著降低肝脏和胰腺对血浆中非转铁蛋白结合的铁（non-transferrin-bound iron，NTBI）的摄取，减缓了肝细胞和胰腺腺泡细胞铁沉积，从而减轻肝脏和胰腺的铁负荷以及铁超载相关病理损伤［37］。同样，金属离子转运体-1（divalent metal transporter 1，DMT1）也可以吸收NTBI，利用肝脏特异的DMT1基因敲除小鼠验证，发现它对肝脏NTBI的摄取和肝细胞铁负荷是必不可少的［37］，说明DMT1调控了铁代谢。因此，SLC39A14和DMT1可通过调节铁代谢在铁死亡中发挥重要的作用。

此外，在另一项研究中，核转录因子-E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）基因敲除小鼠中观察到铁蛋白H的表达降低，说明Nrf2可能参与了铁蛋白H的调节［34］。以上研究提示，转铁蛋白、谷氨酰胺、SLC39A14、DMT1、Nrf2参与了铁代谢，并与铁死亡的发生密切相关。

2.7 其他调节铁死亡的途径研究证明热休克蛋白β-1（heat shock protein beta-1，HSPB1）作为负调节因子参与癌细胞的铁死亡过程。Erastin刺激癌细胞的热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）依赖于HSPB1的表达或磷酸化，从而减少铁引起的ROS的产生，进而减缓癌症的损害［38］。LIU Y等［39］利用谷氨酸处理HT22细胞，发现细胞死亡明显增多，但这种作用可被5-脂氧合酶抑制剂抑制，这种抑制剂主要是减少谷氨酸诱导的活性氧的产生，却不能减少谷胱甘肽的消耗，同时这种谷氨酸诱导的HT22细胞死亡能被铁死亡抑制剂铁抑素-1显著抑制。因此，5-脂氧合酶抑制剂部分地通过抑制铁死亡来保护神经元免受谷氨酸诱导的氧化应激损伤［39］。此外血红素加氧酶-1是铁死亡过程中的重要酶，有学者认为其可能参与细胞内铁的补充，增加脂质过氧化物水平，从而促进Erastin诱导铁死亡［6］。总之，铁死亡依然存在一些待发现的机制，值得进一步深入研究。

3 铁死亡与新生儿缺氧缺血性脑病

HIE是由于新生儿围产期窒息引起缺氧缺血的神经系统疾病，其病理生理变化构成一个级联反应过程，最终引起神经细胞的死亡，是导致临床上新生儿高发病率和致残率的重要原因之一［40］。目前HIE的发病机制尚不十分明了，主要涉及氧化应激、线粒体功能障碍、谷氨酰胺能兴奋毒性和细胞凋亡等［41］。以此为基础应用于临床治疗上的效果改善并不明显［40］，说明HIE中存在更加复杂的发病机制，这使得治疗HIE存在较大困难，因此，我们需要对HIE的损伤机制有更深入的挖掘。在HIE中涉及多种细胞死亡类型，如凋亡、坏死、自噬、焦亡，最近发现还与铁死亡有关［5，42］。而铁死亡作为一种新发现的细胞死亡方式，在HIE中的作用机制尚不清楚，因而探究其与HIE之间的关系及存在的潜在机制，对HIE的治疗提供新的途径具有重要意义。

有研究显示，铁死亡存在于多种神经系统疾病中，如脑出血、脑缺血再灌注损伤、帕金森病等［4］。研究发现，在胶原酶诱导的小鼠脑出血模型中发生了铁死亡，并且给予铁死亡抑制剂铁抑素-1可以减少铁沉积，阻止海马神经元死亡，以及改善小鼠的神经功能［43］，说明铁死亡参与了脑出血的神经损伤过程。同样，在脑缺血再灌注损伤动物模型中通过鼻腔注射铁螯合剂去铁胺可以大幅度减少脑损伤面积，展现出显著的保护作用［44］。铁死亡的相关机制也出现在HIE的病理过程中，如氧化应激、脂质过氧化、线粒体功能障碍、铁代谢失衡等［45］。

在缺氧缺血（hypoxic ischemic，HI）期间，大量的自由基和活性氧的累积可引起氧化应激，是导致大脑病理损伤的重要原因［46］。生理情况下，ROS主要产生于线粒体，并由谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶清除。而在缺氧缺血期间，由于代谢障碍，抗氧化酶不能立即清除ROS，导致ROS过量积累，引起脂质过氧化［40］。线粒体功能障碍也可致线粒体内脂质过氧化物的积累，在HI诱导的神经损伤中起到关键作用［47］。然而，越来越多的证据支持，线粒体功能障碍可引起铁蓄积和脂质过氧化，从而促进铁死亡的发生［48］，提示线粒体功能障碍可能通过引发铁死亡而在HIE中发挥神经损伤作用。此外，临床研究表明，围产期窒息新生儿脐带血中发现脂质过氧化产物丙二醛的水平明显升高，并且与脑损伤严重程度呈正相关［49］，进一步表明铁死亡可能在HIE中发挥重要作用。

铁对大脑发育发挥着重要的作用。在生理条件下，大部分的铁与蛋白质结合而储存，对机体无害［50］。然而游离铁可通过Fenton反应产生有害物质，对蛋白质、核酸造成损害及引发脂质过氧化，造成细胞铁死亡［51］。脑铁代谢可能在HIE中发挥着重要的作用。在HIE的临床研究中发现，新生儿脐带血中游离非蛋白结合铁（non-protein-bound iron，NPBI）增加，而NPBI可通过Fenton反应产生活性氧，破坏细胞膜，一旦NPBI穿过血脑屏障，神经细胞损伤可能变得更严重［52］。HIE动物模型的研究表明，通过向脑内注射转铁蛋白对脑白质损伤有缓和作用，并且可以减少神经元丢失［53］。促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）在多种神经系统疾病中具有抗氧化、抗凋亡的作用。此外，EPO还促进红细胞生成，进而调节铁稳态［54］。研究发现，促红细胞生成素不仅在HIE动物模型中具有神经保护和促进再生作用，而且在临床上也显示出神经保护及改善预后作用［55］。有学者认为，在缺氧环境下，EPO可以通过催化铁螯合间接抑制Fenton反应，清除自由基，从而起抗氧化作用［54］。因此，脑内铁代谢可能参与了HIE的发病过程。

此外，谷氨酸的兴奋毒性作用是引发神经元和胶质细胞铁死亡的原因之一［56］。在中枢神经系统中谷氨酸/胱氨酸逆转运蛋白System Xc-是一种重要的抗氧化防御机制。研究发现，谷氨酸可通过抑制System Xc-，导致谷胱甘肽水平降低，引起少突胶质细胞铁死亡［56］。同样，这种由谷氨酸介导的System Xc-抑制和谷胱甘肽水平降低的细胞毒性作用也早已在神经元细胞系中被证实［57］。而在新生儿缺血缺氧期间，谷氨酸受体的过度刺激及细胞外谷氨酸水平的提高被认为是造成脑损伤的重要发病机制［40］。同时，临床研究也显示，在中重度缺血缺氧性脑病的新生儿脑脊液中检测到高水平的谷氨酸［58］。由此，HIE中的谷氨酸毒性作用也可能涉及类似于上述谷氨酸介导的铁死亡机制。

虽然新生儿大脑发育情况与成人相比较为复杂，细胞死亡机制也大不相同，但在HIE的临床和动物模型研究中均发现铁死亡存在的特征［5］。总之，铁死亡在HIE脑损伤中可能发挥重要作用，探究其在HIE中的潜在机制对治疗HIE具有巨大的潜力。