干细胞来源外泌体在急性肝衰竭炎症驱动中的应用价值

唐慧昕 张译之 陈煜

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是无基础肝病的患者2周内出现II度及以上肝性脑病并伴乏力、黄疸、凝血功能障碍及肝脏进行性缩小等的一组临床综合征[1-3]。病因多样，病理表现为肝内弥漫性炎性细胞浸润和大量肝小叶坏死，肝细胞功能障碍发展迅速[4]，并可进一步发展为脑水肿、败血症和多器官衰竭，最终导致死亡。ALF的年发病率在全球约为1～6例/100万，死亡率高，治疗费用昂贵[1,4-5]。目前ALF的治疗方案主要是内科综合治疗、非生物型人工肝支持治疗和肝移植[3]。然而，内科治疗ALF患者的病死率仍高达70%以上[6]、人工肝治疗肝病人群受限、肝移植供体肝的缺乏、术后并发症的高发生率以及难以负担的经济成本限制了目前临床的治疗[1,5]。干细胞移植治疗肝病近年来受到广泛关注，它是具有自我更新和自我复制能力的非终末分化细胞，具有分化为不同类型组织和细胞的潜能[7]，可以促进肝再生，然而移植后细胞存活率低、在体外难以扩增、易失去肝脏特性并有发生恶性转化的风险，因此干细胞的应用同样有限[8-9]。为了弥补目前治疗方案的不足，有研究表明，以干细胞来源外泌体为基础的治疗有望成为一种新的有效的治疗策略。

干细胞来源的外泌体是干细胞释放的细胞外囊泡[10]，大小在30～150 nm之间。其不仅可以通过旁分泌的形式传递到其他细胞执行功能，还可以靶向靶细胞触发下游信号，发挥抗炎、抗凋亡和免疫抑制作用，促进组织修复，提高抗炎细胞因子水平[11-12]。由于其天然的物质转运特性和良好的生物相容性，外泌体还可以作为药物载体促进药物的转运和吸收[1]。目前干细胞来源外泌体在ALF的治疗研究中取得了一定进展，本文将从ALF与炎症的关系及干细胞来源外泌体对ALF炎症反应的调节等方面作一汇总。

一、急性肝衰竭和炎症

肝脏的主要功能之一是参与先天性免疫，而模式识别受体(PRRs)是天然免疫系统中的重要分子。它们识别病原微生物表面高度保守的病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤组织与细胞释放的损伤相关分子模式(DAMP)，激活下游信号转导通路，诱导损伤部位的炎症细胞浸润，促进炎症因子的释放，进一步加剧损伤组织的炎症状态，并驱动和调节适应性免疫反应[13]。

越来越多的研究表明，由非感染源介导的损伤可引起炎症反应，而病理性的细胞死亡是无菌性炎症的主要原因[14]。细胞死亡后，细胞膜对细胞内的内容物通透性增加。当细胞裂解时，内容物被释放。然后这些分子与Toll样受体(TLRs)等模式识别受体结合，从而诱导炎性细胞因子[如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8]的产生与释放，导致级联性的炎症反应。TNF-α在由病毒感染、脂肪变性、自身免疫和酒精或对乙酰氨基酚(APAP)引起的急性或慢性肝炎的炎症反应中发挥关键作用[15]。IL-1β与早期炎症反应和有毒物质有关，其水平升高激活免疫细胞合成和释放许多参与免疫反应的炎性细胞因子，导致炎症和组织破坏[16]。IL-6刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化，并增强其功能[17]。IL-8水平可反映器官对毒物炎症反应的严重程度[18]。机体暴露于各种肝毒性因素后首先激活TNF-α和IL-1β，诱导TNF-α和IL-1β促进IL-6、IL-8等炎性细胞因子的上调，导致炎性细胞因子的级联反应进而加重ALF。

ALF是一个以炎症反应为主的肝细胞损伤过程，多种肝毒性因子如刀豆蛋白A(ConA)、对乙酰氨基酚(APAP)和脂多糖(LPS)可诱导炎症反应及免疫功能紊乱，导致ALF，而炎症的级联反应和免疫应答失衡在ALF的发病和转归中起着关键作用[19]。研究表明，与健康对照组相比，ALF患者体内C3和C5补体水平降低，中性粒细胞吞噬功能受损，肝内嗜酸性粒细胞、C反应蛋白(CRP)和促炎因子IL-6水平较高，而抗炎因子IL-5水平较低[20-21]。另外ALF患者中CD8+干扰素-γ+T淋巴细胞数量是明显增加的，细胞因子如IL-10、TNF-α和IL-12也显著上调[20]。因此，迫切需要有效的治疗策略来抑制多因素诱导的ALF炎症反应。

二、干细胞来源外泌体对ALF炎症反应的调节作用

干细胞培养上清液中提取外泌体治疗ALF的研究不断有报道。目前研究认为外泌体主要是通过抑制炎症因子分泌或阻断多条信号转导途径的载体等来防止肝脏炎症、纤维化和器官的进一步衰竭，不同干细胞来源的外泌体对炎症因子及通路的调节有所不同。

(一)不同干细胞来源外泌体对ALF的炎症调节

1.人骨髓间充质干细胞来源外泌体(BMSC-Exos)：BMSC-Exos可显著降低ALF小鼠血清中的干扰素-γ(IFN-γ)、IL-1β和IL-6水平，明显升高细胞因子IL-10的水平。ALF的体外模型显示[22-23]，BMSC-Exos可诱导肝细胞转变为卵圆形细胞前体细胞，并通过补充肝细胞修复受损的肝脏。Shuxian Zhao等[24]通过D-氨基半乳糖/脂多糖(D-Gain/LPS)诱导ALF大鼠模型，发现BMSC-Exos可上调自噬相关蛋白LC3II和Beclin-1的表达，促进自噬小体的形成。经BMSC-Exos处理后，促凋亡蛋白Bax和裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达水平明显降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平上调。然而，当自噬抑制剂3MA存在时，BMSC-Exos抑制凋亡的作用明显逆转，自噬相关蛋白LC3II和抗凋亡蛋白Bcl-2减少，促凋亡蛋白caspase-3增加。此研究证实，BMSC-Exos可通过激活自噬来减轻D-Gain/LPS诱导的肝细胞损伤和凋亡。

2.人经血干细胞来源外泌体(MenSC-Exos)：有研究使用MenSC-Exos治疗D-Gain/LPS诱导的ALF小鼠模型，与对照组相比，MenSC- Exos预处理的小鼠血清中的ALT和AST水平明显低于D-Gain/LPS单独处理组；显著下调了血清及肝组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，抑制了肝细胞凋亡及caspase-3的表达。流式细胞术检测表明，MenSC-Exos可抑制肝脏炎症细胞(巨噬细胞、单核细胞)的募集，减少炎症细胞的数量。此研究表明，MenSC- Exos通过抑制炎性细胞因子的产生来预防D-Gain/LPS诱导的ALF，进而改善肝功能、降低死亡率[25]。

3.人脐带间充质干细胞来源外泌体(hUCMSC-Exos)：研究表明，hUCMSC-Exos可通过抑制巨噬细胞活化，显著降低血清中ALT和AST水平，促进肝细胞增殖；还可以通过传递谷胱甘肽过氧化物酶-1(GPX1)，上调ERK1/2和Bcl-2水平，下调IKKB/NF-kB/Casp-9/3通路，抑制氧化应激诱导的细胞凋亡[26-27]。Wu等[28]研究发现，hUCMSC-Exos显著下调APAP诱导的ALF小鼠肝组织中炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，且降低了MDA、恢复了肝脏SOD活性；明显抑制了肝细胞凋亡，改善了肝功能，提高了小鼠存活率。Shao等[29]利用LPS诱导ALF小鼠模型，发现在IL-6刺激下产生了大量富含miR-455-3p的hUCMSC-Exos，这些外泌体可靶向PIK3r1，抑制LPS攻击的巨噬细胞释放炎症因子, 改善了肝损伤并维持了系统内稳态。

4.人子宫内膜间充质干细胞来源的外泌体(HuES9.E1 MSC-Exos)：

HuES9.E1 MSC-Exos通过上调STAT3和抑制核因子-κB(NF-κB)途径显著逆转小鼠ALF。同时给予HuES9.E1 MSC-Exos可减轻四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠损伤，外泌体处理组小鼠肝脏NF-κB基因表达增强。在APAP和过氧化氢(H2O2)处理诱导的ALF小鼠体外模型中，外泌体组上调了细胞增殖标志物的表达，表明HuES9.E1 MSC-Exos在急性损伤过程中促进了肝细胞的再生和增殖，其NF-κB和磷酸化STAT3活性恢复到损伤前的正常表达水平。此外，HuES9.E1 MSC-Exos还通过上调Bcl-xL抑制APAP和H2O2诱导的肝细胞凋亡蛋白的表达[30]。

5.人脂肪间充质干细胞来源外泌体(AMSC-Exos)：AMSC-Exos用于治疗D-Gain/LPS诱导的ALF，血清中的ALT和AST水平显著降低。AMSC-Exos可被肝巨噬细胞摄取，减少血清中炎症因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6和IL-18)的分泌，并能激活巨噬细胞中的炎症复合体(NLRP3、Caspase-1和Asc)，其中NLRP3炎性小体激活的关键因素是TXNIP，TXNIP的过表达逆转了AMSC-Exos对LPS刺激的巨噬细胞炎性小体激活的抑制作用。且AMSC-Exos含有高水平的miR-17家族miRNAs，尤其是miR-17，其可以通过靶向TXNIP和调节肝巨噬细胞中炎性小体的激活，从而改善ALF[31]。

(二)外泌体抑制ALF炎症中的信号转导通路

1.JNK、NF-κB、STAT3等信号通路：许多研究表明，多条信号通路包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NF-κB和核苷酸结合域样受体蛋白3(NLRP3)在 ALF的炎症反应中起着重要的调节作用[32]。MAPK家族由c-jun-N末端激酶、p38激酶和细胞外信号调节激酶组成，可调节COX-2、IL-1β和IL-6等因子的转录[33]。JNK是一种应激和丝裂原激活的蛋白激酶，是促凋亡途径的关键因子。激活的JNK可转移到细胞核，促进肝细胞死亡相关基因的转录和表达。此外，NF-κB含有p50/p65和I-κB蛋白抑制剂，在宿主防御中有着非常重要的作用，并可介导促炎介质和细胞因子的表达。在巨噬细胞中，STAT3通过抑制STAT1信号通路，进而减少IL-12、IL-27和IFN-γ等细胞因子的产生。STAT3还可以抑制NF-κB信号转导途径，导致IL-6、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和TNF-α等细胞因子的产生减少。最后，这些细胞因子以肝细胞为靶点，促进或预防肝细胞损伤。NLRP3是一个多蛋白复合体，一旦受到LPS等因素的刺激，NLRP3蛋白则会聚并结合到Asc接头上，然后促进caspase-1的招募并激活成熟形式的IL-1β，最终释放IL-1β和IL-18，导致炎症反应[34]。

不同来源的间充质干细胞产生的外泌体抑制了ALF中相关信号通路的激活。如上所述的HuES9.E1MSC-Exos通过上调STAT3和抑制NF-κB途径显著逆转小鼠的ALF，使NF-κB(p50和p65)和磷酸化STAT3的活性恢复到损伤前的正常表达水平[30]。用质谱和抗体阵列分析外泌体中的蛋白质成分，发现IL6ST蛋白通过激活IL-6/STAT3途径在肝细胞保护中发挥重要作用；CXCL2/MIP-2可通过上调STAT3促进肝细胞增殖来减轻肝损伤。hUCMSC-Exos则通过上调ERK1/2和Bcl-2水平，下调IKKB/NF-κB/Casp-9/3通路，抑制氧化应激诱导的细胞凋亡[26-27]。AMSC-Exos[31]可激活巨噬细胞中的炎症复合体NLRP3、Caspase-1和Asc，其中NLRP3炎性小体激活的关键因素是TXNIP，AMSC-Exos中含有高水平miR-17，其可以通过靶向TXNIP和调节肝巨噬细胞中炎性小体的激活，从而改善ALF。

2. TNF-α途径与肝细胞生长因子/c-蛋氨酸轴(HGF/c-Met)

除了上述主要信号通路外，TNF-α通路在急性炎症性疾病，包括全身炎症反应综合征(SIRS)和ALF伴发急性器官损伤中也起着关键作用。TNF-α功能障碍的信号转导通路可导致细胞死亡，释放风险相关的分子模式因子，激活组织中的中性粒细胞和巨噬细胞分泌TNF-α和其他促炎细胞因子或趋化因子，进而招募多形核白细胞(PMN)进入受损组织，加剧级联反应。此外，TNF-α也是急性创伤后组织修复的主要调节因子之一，其可激活p38MAPK和NF-κB信号转导通路，诱导细胞增殖和分化，激活常驻祖细胞，动员循环干细胞促进组织再生[35]。TNF-α可启动肝再生所依赖的NF-κB和IL-6信号转导通路，启动G1期的STAT3转录因子，而经HuES9.E1MSC-Exos处理的受损肝细胞显著增加了TNF-α激活的NF-κB和STAT3的表达。IL-6/STAT3通路随后启动了从G1期到S期的细胞周期，这与外泌体处理后细胞周期蛋白D1和PCNA的上调是一致的。上调的基因和蛋白表达水平共同促进细胞活性的恢复，这表明外泌体可通过诱导肝细胞再生来介导ALF的肝修复。此外，HGF/c-Met轴也与ALF有关。HGF是肝损伤后肝再生修复过程中最重要的有丝分裂原，其生物学效应是由单一酪氨酸激酶受体c-Met介导的[36]。肝病患者血清中的HGF水平在一定程度上可反映肝损伤和肝功能障碍，在大鼠肝部分切除(PH)后，HGF蛋白水平及其受体c-Met的活性即刻升高。HGF过表达或外源性HGF可诱导肝细胞增殖，加速大鼠PH后的肝再生过程。在体内，HGF和c-Met可以沉默RNAi，此时肝再生受到破坏，许多与细胞周期和凋亡相关的基因表达模式出现异常。这表明HGF/c-Met信号通路在肝再生中起着至关重要的作用，而HGF在MSC来源的外泌体中含量丰富。

三、总结与展望

近年来，干细胞来源的外泌体在治疗肝脏疾病方面取得了一些进展。不同干细胞来源的外泌体在肝脏多种细胞类型之间的信息传递中起着关键作用。它们可以改变靶细胞的功能，激活不同的信号转导途径，从而抑制肝脏疾病的发生和发展，有望为治疗和诊断提供新的思路，但目前这一领域仍处于初级阶段。随着对外泌体的深入研究，相信在不久的将来其可以成功应用于ALF及其他肝脏疾病的治疗。