微小RNA参与调控肝细胞癌耐药的相关研究进展

罗舒 陈非 秦蓉声 陈英 朱鹏

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上十分常见的恶性肿瘤，导致了十分严重的卫生及社会负担[1]。由于慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)及丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染的人群基数巨大，我国HCC的发病率一直处于较高水平。HCC的致病机制十分复杂，病毒、遗传、酒精等均是导致HCC发生的高危因素[2]。对于不适于手术治疗的中晚期HCC，系统性化疗、靶向及免疫治疗药物被证实可有效延长患者生存时间，这些药物包括索拉非尼、瑞戈非尼、PD-1抑制剂、阿霉素、铂类药物等[3]。即使上述药物得到了广泛应用，绝大多数晚期HCC患者仍在短期内病死。HCC耐药十分常见，是导致药物疗效较差及预后不佳的重要原因之一。目前HCC耐药的相关机制仍未完全阐明，学者也尝试从分子生物学的层面阐述HCC耐药的相关机制，也取得一些新的研究进展[4]。微小RNA(micro-RNA，miRNA)是不具有翻译功能的非编码RNA(通常包含22个核苷酸序列)，其种类繁多且分布广泛，参与了对各类病理生理过程的调控[5]。特异miRNA主要通过靶向结合到特定基因的3’-非编码区(untranslated regions，UTRs)来抑制该基因翻译相应的功能蛋白，从而发挥相应的功能。大量的研究数据显示，特异miRNA通过影响多类信号传导通路参与了调节HCC致病及进展的全过程，包括对HCC耐药的调控[6, 7]。因此，本文对上述问题相关的最新研究进展进行了简要的综述。

一、miRNA参与对HCC增殖及转移的调控

HCC的发生机制十分复杂，而现有的研究数据也显示特异性miRNA在HCC的发生与发展中发挥着重要的调控作用[8]。现有的研究大多仅对单个异常表达的miRNA功能机制进行了分析，但是miRNA对HCC增殖及进展的调控作用受多方面因素影响，不同miRNA、靶基因及功能蛋白之间可形成复杂的调控网络来影响细胞功能，从而参与疾病形成与进展。随着分析技术的发展，对miRNA调控网络的研究也能够更为深入，有助于进一步阐述miRNA在HCC发生及发展中的调控作用。

相关的研究方面，如Sulas等[9]发现，与健康对照相比，早期HCC患者癌组织中即存在30种miRNA的表达异常，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析显示，这些miRNA的主要调控靶点基因与HCC中细胞周期调控、凋亡、侵袭等功能具有重要的相关性。Tian等[10]的最新研究发现，与正常肝组织相比，HCC癌组织中的miRNA-497-5p的表达显著降低，而其靶向调控的基因ACTG1(编码重组人肌动蛋白γ1)、CSNK1D(编码酪蛋白激酶δ1)、PPP1CC(编码蛋白磷酸酶催化亚基)及BIRC5(表达含杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列蛋白5)等均存在显著升高。且miRNA-497-5p表达越低，HCC瘤体越大，提示miRNA-497-5p通过对上述基因的调控参与了对HCC肿瘤的增殖调节。Wang等[11]也发现，HCC患者外周血清中的miRNA-1290表达存在显著升高，将miRNA-1290质粒转导入内皮细胞可显著增强内皮细胞的血管生成能力。机制研究显示SMEK1是miRNA-1290的靶向调控基因，SMEK1基因编码的SMEK1蛋白(分裂原活化蛋白激酶抑制蛋白)具有抑制VEGFR2功能的作用，而miRNA-1290能够通过降低SMEK1表达来促进HCC瘤体中的血管生成，从而促进HCC的生长。Chen等[12]的研究也显示，在HCC癌组织及细胞株中，miRNA-369-3p的表达存在显著降低，体外实验显示，增高miRNA-369-3p的表达可以抑制模型细胞的增殖，机制分析显示SOX4是miRNA-369-3p的靶向调控基因，而SOX4是胚胎发育及细胞周期的重要调控基因，在恶性肿瘤的发生中有重要调节作用。Yang等[13]的研究也发现，HCC癌组织中的miRNA-23b-5p的表达降低明显，功能分析显示，无论是在体内还是体外实验中miRNA-23b-5p均能够诱导G0/G1期细胞周期重置。荧光素酶检测显示FOXM1基因(编码具有致肿瘤作用的哺乳动物叉头框蛋白M1)是miRNA-23b-5p的直接靶向调控基因，miRNA-23b-5p通过抑制FOXM1的表达来减弱cyclin D1及c-MYC蛋白的表达，从而抑制HCC肿瘤细胞的增殖。

转移是HCC的重要临床特点及致死的主要原因，既往研究证实细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是恶性肿瘤发生侵袭及转移的重要机制，miRNA也通过参与对EMT的调节来影响HCC的侵袭及转移[14]。如Li等[15]的研究发现，与慢乙肝患者及健康对照相比，CHB相关HCC患者血清miRNA-487b表达水平存在显著升高，且高miRNA-487b表达与不良预后存在相关性，增强miRNA-487b表达可显著增强肿瘤细胞的增殖、分化及侵袭能力，提示了miRNA-487b是促进HCC远处转移的重要功能分子。Liu等[16]也发现，HCC患者肿瘤细胞中miRN-129-5p的表达存在异常升高，且高表达miRNA-129-5p的细胞增殖能力及侵袭能力更强。同时在临床队列中也发现，miRNA-129-5p的高表达与HCC患者更高的远处转移率及更差的预后存在相关性。机制分析显示骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein 2，BMP2)基因是miRNA-129-5p的下游靶标基因，而BMP2具有增强肿瘤细胞DNA合成及细胞复制的功能，同时还参与了肿瘤细胞的EMT过程，对肿瘤侵袭具有促进作用。此外，Cao等[17]的研究也发现，在HCC癌组织及模型细胞中可观察到miRNA-19a-3p及miRNA-376c-3p的表达升高，降低miRNA-19a-3p及miRNA-376c-3p的表达可以减缓HCC的进展。生物信息学分析及荧光素酶实验显示SOX6基因是上述miRNA的共同作用靶基因，SOX6基因编码的SOX6蛋白能够阻断Wnt/β-catenin信号通路(恶性肿瘤EMT过程中发挥调控功能的重要信号通路)的表达，从而影响肝癌细胞的侵袭转移能力。这也提示miRNA-19a-3p及miRNA-37c-3p的异常表达可能影响HCC的侵袭及转移。上述研究结果均提示了特异性miRNA在HCC的侵袭及转移过程中发挥着重要的调控作用。

二、miRNA与索拉非尼耐药

索拉非尼是口服酪氨酸激酶抑制剂，大量研究证据显示其可以有效延长晚期HCC患者的总体生存时间，因此被各大临床指南推荐作为中晚期HCC的一线治疗药物[18]。从2007年开始，随着索拉非尼的广泛应用，虽然使很多HCC患者得到了生存获益，但是由于HCC本身复杂的生物学特性及索拉非尼较短的疗效持续时间，HCC对索拉非尼的耐药问题也逐渐显现[19]。

一方面，特异性miRNA参与了HCC对索拉非尼耐药的形成。相关的研究方面，如Dietrich等[20]的最新研究显示，索拉非尼耐药的HCC中miRNA-622表达显著降低，而野生型鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)是miRNA-622的靶向调节基因，KRAS具有促肿瘤细胞生长及血管生长的作用，miRNA-622表达降低所致的KRAS表达升高可导致肿瘤新生血管能力增强，从而引起对索拉非尼的耐药。Han等[21]也发现，HCC原位癌组织中的miRNA-552表达存在显著升高，功能研究显示，miRNA-552能够促进HCC增殖及分化，其主要通过靶向抑制PTEN基因(重要的抑癌基因)的表达来发挥上述作用，而且PTEN基因编码的PTEN蛋白(一种磷脂酶和张力蛋白同源物)具有酪氨酸激酶活性，参与了索拉非尼耐药的形成。此项研究还在临床队列中发现，高miRNA-552表达水平提示更高的索拉非尼耐药率及更差的预后，且miRNA-552可能作为预测索拉非尼远期疗效的风险因素。Kabir等[22]基于Huh-7(常用的肝癌细胞系)细胞株对索拉菲尼耐药机制进行了研究，结果显示，对索拉非尼耐药的Huh-7细胞中miRNA-7-5p表达存在显著降低，功能分析提示miRNA-7-5p表达降低可导致TYRO3基因(编码酪氨酸蛋白激酶受体TYRO3)表达增强，从而增强PI3K/AKT信号通路(细胞内重要的促生存信号通路)的表达，在增强细胞增殖及侵袭能力的同时，增强Huh-7细胞对索拉非尼的耐受度，加重耐药形成。

另一方面，基于特异性miRNA在HCC对索拉非尼耐药形成中的重要调控作用，学者们也尝试通过靶向调控miRNA来改善索拉非尼的疗效，尤其是降低耐药的发生率。相关的研究方面，如Wan等[23]的研究发现，HCC患者癌组织中miRNA-216a-3p的表达与MAPK4蛋白(丝裂原活化蛋白激酶4)表达水平相关。增强miRNA-216-3p的表达可以提高肿瘤细胞对索拉非尼的敏感性，而miRNA-216-3p的这一功能作用主要是通过抑制MAPK4的表达来降低MEK/ERK/ATF2信号通路活性来实现。值得一提的是，研究还在相应的动物模型中验证了上述结论，提示了高miRNA-216a-3p表达与更佳的索拉非尼疗效相关。Zhao等[24]基于HCC细胞模型的研究发现，提高miRNA-424表达可以抑制CBX4基因(编码染色体盒同源物蛋白4)的表达，从而增强索拉非尼的体外抗肿瘤活性。上述作用主要是由于CBX4能够诱导YAP1(Yes关联蛋白1)的激活，而YAP1蛋白是促进癌细胞增殖及转移的重要功能蛋白。Li等[25]也发现，索拉非尼耐受的HCC患者原位癌组织中miRNA-375表达存在显著降低，miRNA-375能够靶向抑制血小板趋化生长因子C基因(PDGFC)的表达来抑制肿瘤新生血管生长，而通过升高miRNA-375表达则可以增强索拉非尼的抗肿瘤血管生成作用，从而抑制HCC生长。Li等[26]的也研究发现，miRNA-93具有增强肝脏细胞的瘤变趋势的功能，干扰miRNA-93表达则可以逆转上述作用。此外，索拉非尼耐药的HCC肿瘤组织中miRNA-93表达存在显著升高，通过抑制miRNA-93的表达则可以增加对索拉非尼治疗的敏感性。同时研究者还在临床患者队列中观察到低miRNA-93表达的HCC患者能够在TACE或索拉非尼治疗中更多的获益，提示了miRNA-93还可能作为索拉非尼疗效的预测因子。上述研究结果也为将来开发索拉非尼治疗的辅助治疗药物提供了重要思路。

三、miRNA参与其他药物耐药

在临床上，HCC不仅存在对索拉非尼的耐药，对如顺铂、阿霉素等临床应用较多且应用时间较长的药物也存在耐药的情况。耐药可能导致患者肿瘤快速进展及病死率增高，同时也增加了患者的负担。特异的miRNA不仅在索拉非尼耐药中有着重要调控作用，也有大量研究显示，miRNA也参与了如氟尿嘧啶、铂类、阿霉素等药物耐药的形成[27]。其他药物如乐伐替尼、瑞戈非尼、PD-1/PD-L1抑制剂等，由于临床应用时间较短，耐药情况及机制分析相关的研究证据仍较为匮乏，下一步的研究中还需要更加关注HCC对这些新型药物的耐药情况及特定miRNA在其中的调控机制。

铂类药物是临床上应用较多的治疗恶性肿瘤的药物，主要包括顺铂、卡铂、奥沙利铂等， HCC对铂类药物的耐药在临床上也较为常见。特异性miRNA的异常表达在其中也发挥了重要调控作用。如Zeng等[28]的研究发现，在HCC模型细胞中，转染miRNA-138微粒可以显著增强顺铂治疗的敏感度。荧光素酶分析显示，miRNA-138主要的靶基因是EZH2(编码组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶)，而且miRNA-138主要通过抑制EZH2的表达来减缓顺铂治疗所诱发的EMT，从而发挥改善治疗效果的作用。Li等[29]的研究也发现，在顺铂耐药的HCC组织中存在miRNA-155-5p表达升高，使用靶向miRNA-155-5p的circARNT21抑制miRNA-155-5p表达的同时可升高PDK1(丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1，主要参与细胞的能量代谢调节)表达，PDK1表达升高可以抑制肿瘤细胞的糖酵解，从而改善HCC细胞对顺铂的耐药。Liu等[30]的研究也显示，HCC原位组织及模型细胞中抑癌基因CASC2(癌易感性候选基因2)的表达存在显著降低，尤其是在对顺铂耐药的细胞中，且低CASC2表达与HCC患者不良预后相关。基于体外细胞试验显示，增高miRNA-222的表达则可以抑制CASC2表达，并增强HCC细胞对顺铂的敏感度，提高顺铂治疗效果。

阿霉素也是临床上应用较多的抗HCC药物，其耐药的情况也相继得到了报道，miRNA异常表达也参与了HCC对阿霉素耐药的调节。如Cui等[31]的研究发现，增高miRNA-200a的表达可以抑制肿瘤代谢(包括ATP生成、线粒体呼吸、糖代谢等)，而降低miRNA-200a表达则可以增强上述代谢过程。此外，研究还发现，增高miRNA-200a表达的同时还可以增强肿瘤细胞的自噬作用以及提高阿霉素的治疗效果，改善对阿霉素的耐药。Yuan等[32]也观察到，HCC组织及细胞模型中miRNA-26a-5p的表达存在显著降低，功能实验显示，在细胞株中加入miRNA-26a-5p微粒可以降低HCC细胞的增殖程度，而且加入miRNA-26a-5p微粒后还可以增强HCC细胞株对阿霉素的治疗敏感度，进一步的机制分析显示，miRNA-26a-5p的上述作用主要是通过靶向抑制极光激酶A表达来实现，而极光激酶A是肿瘤细胞有丝分裂的重要调节因子。此外，Gao等[33]的研究也发现，与癌旁及正常肝脏组织相比，HCC原位组织中的miRNA-140-5p表达程度更低，而在HCC细胞系中加入miRNA-140-5p微粒则能够显著增强阿霉素治疗的敏感度，减弱对阿霉素的耐药。进一步的机制分析显示，PIN1基因是miRNA-140-5p的靶向调控基因，而PIN1基因主要编码肽酰脯氨酰顺/反异构酶蛋白结合蛋白1，其主要是在细胞有丝分裂及周期循环中发挥调节作用。

综上所述，HCC的耐药问题是困扰临床治疗和影响患者预后的重要原因。特异性miRNA在HCC的发生与发展中发挥重要功能，也参与了HCC耐药的发生。通过靶向调节特定miRNA的表达有可能进一步开发改善耐药的药物方法，从而提高针对HCC的临床疗效。虽然目前的大多数相关研究都只停留在细胞及动物模型层面，但均显示出了积极的结果，下一步的研究仍需更深入的探讨miRNA参与HCC致病的相关机制，并尝试通过改进药物合成技术来开发更为安全有效的靶向miRNA治疗方法，从而为降低HCC耐药率提供安全有效的方法，使更多的患者从中获益。