6-甲基腺嘌呤RNA甲基化与眼科疾病的研究进展

杨相颖, 安 宁, 谭 耀, 陈 胜,刘静雯, 张福燕, 秦 波

(1. 贵州医科大学 临床医学院, 贵州 贵阳, 550004;2. 暨南大学附属深圳爱尔眼科医院 眼底病眼外伤科, 广东 深圳, 518032;3. 广东省深圳市眼科医院 眼外伤科, 广东 深圳, 518040)

6-甲基腺嘌呤(m6A)RNA甲基化修饰能够影响靶基因的表达，参与了几乎所有的RNA代谢过程，能够调节多种生理过程，包括自我更新、侵袭和增殖[1]。转录后修饰主要涉及了3组酶调控，即甲基转移酶、甲基化阅读蛋白和去甲基化酶。甲基转移酶包括甲基转移酶样3(METTL3)、甲基转移酶样14(METTL14)、甲基转移酶样16(METTL16)、RNA结合基元蛋白15(RBM15)、病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白(VIRMA)、Wilms′tumor-1结合蛋白(WTAP)、CCCH 型锌指蛋白(ZC3H13)等，主要作用是催化RNA上腺苷酸，发生m6A RNA甲基化。甲基化阅读蛋白包括真核起始因子3 (EIF3)、异质核核糖核蛋白A2B1 (HNRNPA2B1)、异质性胞核核糖核蛋白C (HNRNPC)、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白 (IGF2BPs)、YT521-B(YTH)同源结构域家族(YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3), 主要作用是参与mRNA的翻译、加工及降解。去甲基化酶包括肥胖相关蛋白(FTO)和ALK b同源蛋白5(ALKHB5), 主要作用是对已发生m6A甲基化的RNA碱基进行去甲基化修饰[2]。m6A RNA甲基化还能够调控其他RNA[3], 如核糖体RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)、小核RNA (snRNA)、微小RNA (miRNA)、环状RNA (circRNA)、长链非编码RNA (LncRNA)等，这些m6A RNA甲基化在各种生理和病理生物过程中发挥重要作用。目前研究[4]发现, m6A RNA甲基化修饰在许多眼部疾病的发生、发展中发挥着重要作用。随着研究的深入，眼科常见疾病的发病机制将进一步被阐释, m6A RNA甲基化可能成为研究眼科领域可靠的生物标志物。

1 m6A RNA甲基化与白内障

研究发现，年龄相关性白内障(ARC)的形成和发展与晶状体上皮细胞(LEC)中某些基因的表观遗传修饰有关。与正常眼相比, ARC的LEC中5个相关基因的mRNA和蛋白质表达水平增高[5]。已知circRNA在人类晶状体组织中具有一定表达谱及潜在功能，只有少数circRNA的功能在白内障中得到阐明，例如circRNA可以通过miRNA在白内障中表达，其中环状RNA HIPK3(circ-HIPK3)通过环状RNA HIPK3/微小RNA 193a/重组人α晶状体蛋白A链(circHIPK3/miR-193a/CRYAA)通路调节人类LEC增殖和凋亡。环状RNA KMT2E(circKMT2E)的上调可能通过海绵化微小RNA miR-204-5p(miR-204-5p)参与糖尿病白内障的发病机制[6]。研究[7]发现, circRNA修饰的上游调控机制可能与m6A RNA甲基化相关。在年龄相关性皮质性白内障(ARCC)中, circRNA的m6A RNA甲基化大幅度降低。在5种主要甲基转移酶中, ALKBH5在ARCC的LEC中显著上调，提示晶状体组织中甲基转移酶表达的改变可能通过调节circRNA选择性地改变晶状体基因组的表观遗传谱, ALKBH5及circRNA两者表达增高使ARC的易感性增加，这是ARC一个新的发病机制的分子靶点。单纯性核性白内障患者和高度近视的核性白内障患者晶状体前囊膜内m6A RNA甲基化和基因表达也存在差异。m6A的去甲基化蛋白ALKBH5在高度近视核性白内障中表达下降，并通过编码蛋白质来调节细胞外基质的组成，从而使晶状体的结构发生改变。METTL3在糖尿病性白内障(DC)组织标本和高血糖诱导的LEC中上调，降低METTL3表达能促进高糖诱导的LEC的增殖并抑制其凋亡。

2 m6A RNA甲基化与增殖性玻璃体视网膜病变

增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是一种难治性玻璃体视网膜纤维化疾病，视网膜色素上皮(RPE)细胞的上皮间质转化(EMT)是PVR的重要病理机制。研究发现, METTL3参与了PVR过程, METTL3过表达通过诱导细胞周期停滞于G0/G1期而抑制细胞增殖，在体内可抑制PVR过程。METTL3过表达还通过调节Wnt/β-catenin通路减弱转化生长因子β1(TGFβ1)触发EMT的能力，而METTL3基因敲除后能够促进ARPE-19细胞的增殖和EMT。大鼠的玻璃体内过表达的METTL3与对照组相比，实验组PVR的发生较对照组延迟[8]。除了METTL3之外，甲基转移酶ALKBH5和METTL14也参与EMT过程，两者表达增加使YTHDF3表达水平降低, m6A RNA甲基化水平降低和TGFβ1表达增加, TGFβ1增加了上皮间质转化，同时还能诱导血管生成因子促进新生血管形成。

3 m6A RNA甲基化与糖尿病视网膜病变(DR)

DR是糖尿病的主要微血管并发症，已成为严重威胁视力的疾病。炎症、氧化应激和血管生成以及最近发现的神经退行性变[9]是驱动DR发病的主要因素。研究发现, DR过程中检测到m6A RNA甲基化水平升高，且各种非编码RNA如miRNA、LncRNA和circRNA也与DR相关。已有研究[10]证实m6A通过影响这些非编码RNA的剪接和成熟参与影响机体代谢。代谢记忆(遗留效应)是一种与糖尿病相关的现象，指即使血糖恢复正常后，其也不能降低患糖尿病相关并发症的风险。研究[11]表明, m6A RNA甲基化在该病的进展、发病机制与代谢记忆现象存在关联。

3.1 m6A RNA甲基化与DR炎症

DR患者血液和眼部样本中各种炎症细胞因子水平升高[12]。T细胞是炎症的主要调节细胞。METTL3基因缺失可导致T细胞中m6A RNA甲基化水平降低，增加细胞因子信号转导抑制基因(SOCS)家族基因的mRNA和蛋白水平使T细胞增殖和分化得到限制。SOCS家族基因编码信号传导及转录激活蛋白(STAT)抑制蛋白，从而抑制STAT5激活，而STAT5激活是T细胞扩增的关键步骤之一[13]。此外, METTL3介导的m6A RNA甲基化能够通过增强树突状细胞的功能激活T细胞，同时提高炎症反应的有效介质核转录因子κB(NF-κB)信号通路和白细胞介素-12(IL-12)的生成[14], 提示m6A RNA甲基化增加能够使T细胞增殖分化，使机体炎症因子增加。DR中早期病理变化之一是视网膜中周细胞丢失，葡萄糖诱导视网膜细胞中NF- κB活化增加，并促进细胞凋亡，导致周细胞丢失。METTL3过表达也可通过YTHDF2依赖性mRNA衰减介导抑制蛋白激酶Cη(PKCη)、脂肪非典型钙黏蛋白4(FAT4)和血小板源性生长因子受体(PDGFRA)表达来损害周细胞功能[15]。敲除甲基化阅读蛋白YTHDF2的能增加MAPK和NF- κB信号通路[16]。敲低m6A去甲基化蛋白FTO会增加炎症介质干扰素γ(IFN-γ)的表达[17], 表明m6A RNA甲基化修饰与炎症反应相关。DR中甲基转移酶相关基因表达上调，去甲基化酶表达下调，相关m6A RNA甲基化增加，促使炎症反应增加，提示降低m6A RNA甲基化水平可减轻DR中的炎症反应。

3.2 m6A RNA甲基化与DR中氧化应激

氧化应激在DR发展中起关键作用。糖尿病的代谢异常导致大小血管内皮细胞中的线粒体超氧化物过量产生。增加的细胞内活性氧(ROS)会导致血管生成障碍，进一步导致组织缺血，激活炎症通路，并导致时间较长的表观遗传变化，在血糖控制正常后仍然能够使促炎基因持续表达(遗留效应)。视网膜不饱和脂肪酸含量高，摄氧量和葡萄糖氧化水平高于其他组织而对氧化应激高度敏感。转基因糖尿病小鼠中超氧化物歧化酶的过表达可预防DR[18]。顺式二甲基二氯铂(DDP)诱导的氧化应激, YTHDF1低表达能降低KELCH样ECH关联蛋白1(KEAP1)的转录及翻译效率，相反YTHDF1过表达能激活抗氧化基因的关键调控因子之一红系衍生的核因子2相关因子2(Nrf2)[19]。过表达YTHDF1使KEAP1表达减少，使Nrf-2蛋白表达增加, Nrf-2核转位使其发挥抗氧化功能，ROS生成减少。mRNA翻译过程中因翻译停滞产生的应激颗粒会诱导氧化应激[20]。应激颗粒的组装和拆卸受到各种翻译后修饰以及许多核糖核蛋白(RNP)或蛋白质复合物的调节。生理条件下，m6A RNA甲基化修饰需要3个非翻译区(UTR)和停止密码子，而在氧化应激中可观察到5个UTR和5个编码序列(CDSs, 含有最多的DRAC基因片段附近m6A的动态修改，说明mRNA翻译中m6A RNA甲基化在氧化应激状态下更为普遍[21]。应激状态下，氧化应激能使mRNA翻译停滞, m6A RNA甲基水平增加化能使翻译重新启动，提示m6A RNA甲基化在调节关键的抗氧化应激防御系统中发挥重要作用，增加相关基因m6A RNA甲基化可能在DR中起到保护作用。

m6A RNA甲基化在DR的炎症反应及氧化应激中均起作用，在DR的氧化应激中修饰水平升高能够促进炎症的发生，但同时也能减少氧化应激反应，主要原因是提高m6A RNA甲基化水平增加了炎症因子表达的同时增加了抗氧化酶的表达。

4 m6A RNA甲基化与高度近视

高度近视是一种发病率较高的致盲性疾病，严重影响患者的生活质量。近视的病因很复杂，主要是遗传因素和环境影响之间的相互作用的结果。研究表明，家族遗传因素及环境因素各占有一定比例。高度近视眼轴增长，脉络膜变薄，部分区域的脉络膜毛细血管丢失提示脉络膜循环可能在视网膜功能障碍和视力丧失中起重要作用。目前，研究发现, m6A RNA甲基化与高度近视的发病机制密切相关。基因本体论(GO)数据库分析显示，编码含有m6A RNA甲基化峰值的相关基因上调也与循环系统发育、血管发育密切相关，提示高度近视患者眼底m6A RNA甲基化水平升高可能通过影响脉络膜循环而对眼底造成损害[22]。后巩膜葡萄肿是高度近视眼解剖学中最基本的改变之一。高度近视眼中甲基化酶(METTL14)的上调和去甲基酶(FTO和ALKBH5)的下调催化CHI3L1基因的高甲基化，影响其编码几丁质酶样蛋白-40(YKL-40)的表达水平，从而调节细胞外基质的组成促进高度近视的病理状态。增加的m6A RNA甲基化可能通过影响细胞外基质成分而参与后巩膜葡萄肿的形成[23]。

5 m6A RNA甲基化与眼部血管

血管生成异常是许多眼科疾病的重要特征，包括DR、老年黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)和角膜疾病。由于缺少壁细胞和基底膜，新生血管脆弱、易渗漏、易出血，容易发生不可逆转的视力障碍甚至失明。临床常通过消融缺氧的视网膜来抑制视网膜病理性血管生成。视网膜血管生成通常是由缺氧引起的基因失调所驱动的，但其特征、调控机制和在病理性血管生成中的作用尚不清楚。METTL3沉默或METTL3过表达能改变内皮细胞的活力、增殖、迁移和血管形成。沉默METTL3基因能使缺氧诱导的视网膜病变模型中的无血管面积和病理性新生血管减少，并抑制碱烧伤诱导的角膜新生血管形成(CNV)[24]。CNV模型中m6A修饰水平降低。METTL3的过表达介导的m6A RNA甲基化在缺氧条件下通过显著增加Wnt信号通路来促进眼部血管生成[25]。甲基转移酶复合物的关键亚基Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)表达降低可通过减少桥粒斑蛋白(DSP)基因的m6A RNA甲基化调节而抑制内皮细胞血管生成。WTAP表达降低也导致β-连环蛋白的大量降解，从而抑制内皮细胞及血管生成[26]。METTL14和ALKBH5通过影响彼此的表达来抑制甲基化阅读蛋白YTHDF3来确定靶基因的m6A RNA甲基化状态, ALKBH5和METTL14表达增加以及YTHDF3表达水平降低使RNA的m6A甲基化水平降低和TGFβ1表达增加, TGFβ1通过诱导血管生成因子促进新生血管形成[27]。转化生长因子β(TGF β)是导致DR微血管病变的主要因素，因此改变其转化效率和稳定性对DR具有重要作用。

FTO具有高效的氧化去甲基化酶活性。在病理条件下，新生血管化角膜和内皮细胞中的FTO水平增高。在体外内皮细胞中，沉默FTO基因可使细胞增殖、迁移和血管形成减少。在体内, FTO沉默能减少缝线诱导的CNV。内皮细胞中沉默FTO后增加了关键促血管生成基因黏着斑激酶(FAK)的m6A RNA甲基化水平，导致RNA稳定性降低并通过m6A甲基化阅读蛋白YTHDF2增加RNA衰变来减少新生血管的生成。

FTO通过以YTHDF2依赖性方式控制内皮细胞功能来调节病理性血管生成。增加甲基转移酶在体内的表达能够促进m6A RNA甲基化水平，导致眼部新生血管生成。甲基转移酶过表达后在一定程度上会影响甲基化阅读蛋白的表达水平，主要表现为甲基化阅读蛋白表达的下降进一步抑制m6A RNA甲基化。目前研究结果显示，甲基转移酶、甲基化阅读蛋白、去甲基化酶之间的表达水平相互影响，这3种蛋白酶表达升高的总体结果使新生血管生成增加。

6 m6A RNA甲基化与视神经损伤

创伤性视神经损伤导致视网膜神经节细胞(RGC) 功能障碍和死亡、进行性视力障碍是不可逆失明的主要原因。迄今为止，当前的药物或手术治疗还不能使视力完全恢复，轴突再生对于视神经损伤后视力的功能恢复至关重要。视神经损伤后, RGC轴突通常无法再生。视神经损伤后轴突再生的详细的分子机制知之甚少。研究发现，在视神经损伤早期，视网膜组织mRNA中存在大量m6A RNA甲基化的差异性表达[28]。缺血-再灌注(OGD/R)模型诱导神经元损伤，刺激METTL3介导的长链非编码RNA D63785(LNC-D63785)的m6A RNA甲基化，使LNC-D63785下调，致miRNA miR-422a的积累进而使神经元细胞显著凋亡。沉默METTL3或Lnc-D63785能逆转氧糖剥夺再灌注(OGD/R)诱导的Lnc-D63785 m6A RNA甲基化，降低微小RNA 422a(miR-422a)的积累，减少神经元细胞凋亡[29]。m6A甲基转移酶复合物METTL14和YTHDF1的缺失会减少神经损伤中的蛋白质翻译，并减少体内周围神经系统的功能性轴突再生。METTL14低表达后，中枢神经系统中PTEN缺失诱导的视网膜神经节神经元轴突再生减弱[30], 提示m6A RNA甲基化在创伤性视神经病变中的差异性表达和诱导轴突再生的表观转录组学中具有关键作用。

7 m6A RNA甲基化与眼部肿瘤

葡萄膜黑色素瘤(UM)是最常见的成人眼内肿瘤，超过一半的患者在5年后发生转移，结膜黑色素瘤(CM)也是一种罕见且致命的疾病，近30%的患者在10年内死亡。研究提示, m6A RNA甲基化在眼黑色素瘤组织中的表达降低，而过表达的METTLE3或YTHDF1能促进肿瘤抑制因子组氨酸核苷酸结合2(HINT2)的m6A RNA甲基化修饰及蛋白翻译[31]。但是也有研究[32]发现，敲低的细胞色素C(Cyc)或METTL3能下调UM细胞中的酪氨酸蛋白激酶Met(c-Met)、磷酸化蛋白激酶(p-Akt)等和细胞周期相关蛋白水平，通过细胞周期G1停滞抑制UM细胞增殖和集落形成，以及抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。ALKBH5去甲基化酶在葡萄膜黑色素瘤(UM)细胞中表达显著升高, AKLBH5诱导的叉头框蛋白M1(FOXM1) mRNA的m6A去甲基化促进UM中上皮间质转化，并促进UM转移mRNA, 增加其表达和稳定性。下调ALKBH5能抑制UM细胞的增殖、迁移和侵袭，并在体外增加了细胞凋亡[33]。因此，AKLBH5是UM预后及治疗中潜在的标志物和治疗靶点。

8 小 结

DR、眼部退行性变及新生血管、视神经病变、高度近视、玻璃体增殖性病变、白内障、眼部肿瘤等眼部疾病受到外部环境因素、遗传因素及表观遗传学因素等共同影响。研究提示, m6A的甲基化修饰水平在眼部疾病中发挥着重要作用，但其具体功能及作用机制还需要进一步探索及阐明，如Graves′眼病中WTAP、YTHDF2、YTHDC2表达升高，但具体机制不明。本文主要阐述m6A RNA甲基化在常见眼部疾病中的调节作用，在其他眼部疾病中的调节机制仍有待进一步研究。随着人们对眼科疾病发病机制的深入认识, m6A RNA甲基化修饰可能成为阐明相关眼科疾病的发生、发展新的视角，特别是在氧化应激领域。研究[34]已经证实, m6A RNA甲基化与细胞氧化应激密切相关，可能是由HO-1介导的通路，但具体下游信号通路尚需进一步验证。