铁死亡与缺血性脑卒中及其中医药干预研究进展

刘长兴，郭心怡，张雷雷，常翔

脑卒中是全球残疾和死亡的主要原因之一［1］，其可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中以缺血性脑卒中为主，缺血性脑卒中约占所有脑卒中的4/5［2］。缺血性脑卒中是由于脑供血动脉狭窄或闭塞导致脑供血障碍，并导致局部脑组织缺血性坏死或脑软化的一种脑血管疾病［3］。由于脑组织的缺血缺氧，缺血性脑卒中患者神经元的正常血液供应被破坏，进而导致神经元死亡［4］。然而，缺血性脑卒中的发生、发展机制目前尚不完全清楚。随着对细胞死亡研究的深入，铁死亡作为一种新的细胞死亡方式逐渐受到了人们关注，其在形态学、分子机制、免疫特征上不同于其他类型的细胞死亡［5］。近年来，越来越多的研究发现，铁死亡是脑卒中等急性脑损伤患者病理性细胞死亡的重要机制，并且有研究发现，铁抑制剂具有减轻神经功能损伤的功效［6］。因此，本文就铁死亡与缺血性脑卒中的关系及其中医药干预相关研究进行综述，以期为发现缺血性脑卒中药物作用的新靶点提供参考。

1 铁死亡

1.1 铁死亡的特点 铁死亡最早于2012年由DIXON等［7］提出，其是一种铁依赖性的以细胞内活性氧堆积为特征的新型非凋亡性细胞死亡方式。有趣的是，在铁死亡这一概念被提出之前，其诱导剂就已经被确认，研究发现，一种新的Erastin化合物可以杀死RAS基因突变的癌细胞，且该细胞死亡过程不涉及细胞核变化及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3）的活化，该化合物所引起的细胞死亡方式后来被证明是铁死亡［8］。铁死亡不同于凋亡、坏死、自噬和其他形式的细胞死亡，在细胞学方面，铁死亡后细胞内线粒体明显皱缩，线粒体膜密度增加，线粒体嵴消失，线粒体外膜破裂［5，9］。

1.2 铁死亡的发生机制 铁死亡的确切发生机制目前尚不清楚，但有研究表明，其与铁代谢异常、脂质过氧化以及System Xc-失调密切相关［5］。

1.2.1 铁代谢异常 铁参与了细胞的多种生理功能，如氧气运输、线粒体呼吸、DNA复制和细胞信号传递。虽然机体中铁含量很高，但其生物利用度有限，主要以铁离子的形式存在［10］，其在生理pH值条件下不溶于水溶液。铁可以形成铁离子和亚铁离子，从而能够作为过渡金属，在氧化还原反应中轻松地失去或得到电子［11］。通常细胞内的铁是由一个微妙的调节系统所维持的：铜蓝蛋白（ceruloplasmin，Cp）通过氧化从肠道吸收的亚铁离子产生铁离子，并与转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）结合形成转铁蛋白-铁离子（transferrin-Fe3+，TF-Fe3+）复合物，从而被内吞进入细胞［12］；前列腺六跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3）将铁离子还原为亚铁离子，继而二价金属离子转运体1（divalent metal-ion transporter-1，DMT1）将亚铁离子储存在一个铁矿池（labile iron pool，LIP）中［13］。为了维持平衡，多余的亚铁离子会被铁转运蛋白（ferroportin，Fpn）氧化为铁离子，当细胞内存在过量的游离亚铁离子时，其可能通过Fenton反应促进羟基自由基的形成，从而导致DNA、蛋白质和脂质损伤引起的铁死亡［14］。因此，减少细胞内游离亚铁离子，如使用铁螯合剂，可抑制铁死亡的发生。

1.2.2 脂质过氧化 多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是一种主要存在于细胞膜上的脂肪酸，包括花生四烯酸（arachidonic acid，AA）和肾上腺酸（adrenic acid，ADA），其对氧化非常敏感，可导致脂质过氧化氢（lipid hydroperoxide，LOOH）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累［15］。PUFA在细胞内的富集和定位可决定铁死亡的程度。在氧化发生之前，PUFA酯化为膜磷脂〔主要为磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl-ethnolamine，PE）〕，然后通过脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）进一步氧化为氢过氧化物AA-PE-OOH或ADA-PE-OOH，从而诱导铁死亡的发生。在AA-PE或ADA-PE的形成过程中，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（long-chain acyl CoA synthetase 4，ACSL4）和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）被认为是AA和ADA酯化为PE的促进剂［16］。有研究发现，谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）可以抑制ACSL4及LPCAT3的活性［17］。这表明，即使当细胞膜中存在高氧化性PUFA，铁死亡只有在GPX4直接或间接〔即谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗尽后〕失活后才能发生。另外，有研究发现，15-LOX和磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（phosphatidylethanolamine binding protein 1，PEBP1）所形成的复合物对于诱导AA-PE脂质过氧化和形成亲铁质15-HOOAA-PE过氧化物至关重要，而诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）可通过抑制15-LOX/PEBP1的氧化活性来防止铁死亡信号的产生，且该氧化活性独立于GPX4/GSH系统［18-19］。

1.2.3 System Xc-失调 System Xc-是一个由重链亚单位（CD98hc，SLC3A2）和轻链亚单位（xCT，SLC7A11）组成的二硫连接的异质体［20］，其是由细胞内高浓度的谷氨酸所驱动进行转运的，且不依赖ATP，因而在脑组织受损时System Xc-会受到细胞外高浓度谷氨酸的抑制［21］。System Xc-可将细胞外的胱氨酸运到细胞内，然后转化为半胱氨酸用于GSH的合成，而将细胞内的谷氨酸转移出细胞［22］。GPX4将GSH作为辅助因子，进行细胞抗氧化防御。System Xc-可诱导GSH耗竭并间接地使GPX4失活，导致ROS的积累，从而引起铁死亡［23］；或通过抑制谷氨酸-半胱氨酸连接酶〔如丁硫氨酸磺酰亚胺（butylthiocyanine sulfonimide，BSO）〕直接抑制GSH的合成，从而诱发铁死亡［24］。GPX4通过消耗GSH将LOOH还原为脂质醇（lipid alcohol，LOH），GSH被氧化为氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）；然后，GSSG被NADPH依赖的GSH还原酶还原为GSH，从而进入下一个循环［25］。LOOH可以被细胞内的亚铁离子氧化，生成高反应性的氧化脂质自由基，这些自由基可以通过链式反应破坏相邻的PUFA，导致广泛的膜损伤和细胞死亡［26］。同时，GSH可作为不稳定LIP中游离亚铁离子的结合配体，防止其与过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）反应而产生高细胞毒性的羟基自由基［15］。

2 缺血性脑卒中患者发生铁死亡的机制

2.1 铁超载促进缺血性脑卒中患者发生铁死亡 铁超载被认为是缺血性脑卒中患者发生铁死亡的重要原因，因为其具有加剧线粒体氧化损伤和增加脑梗死面积的作用［27-28］。脑卒中患者发生铁超载主要涉及两个方面：铁流入和铁流出［29］。LI等［30］通过大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠模型发现，负责细胞铁流出的血浆CP的丧失可能会破坏铁的平衡，并且加重氧化损伤和增加缺血灶面积，同时损伤神经功能，这表明铁代谢平衡失调可能导致铁超载并引起铁死亡。铁流出也被发现与微管相关蛋白Tau的表达有关，敲除Tau基因的小鼠发生MCAO时，其症状比野生型小鼠更严重，但铁靶向干预可以缓解小鼠的神经功能损伤，这表明Tau可能诱导铁流出并抑制铁超载［31］。此外，VAN LEYEN等［32］也观察到，在缺血性脑卒中的动物模型和细胞模型中NF-κB调控的DMT1表达增加，这与神经元的铁流入增加有关。研究证明，有两种可能的途径是导致缺血脑组织铁超载的原因：其一是缺血期间IL-6表达增加，IL-6可通过上调JAK-STAT3通路来促进铁蛋白表达，进而导致膜铁转运蛋白1（ferroportin 1，FPN1）表达下调和铁释放减少，从而诱导铁超载［33］；另一种铁超载的原因是铁摄取的增加［34］，因为转铁蛋白（transferrin，TF）-TFR1信号通路是神经元摄取铁的主要途径，因而脑组织缺血后TFR1表达水平升高，大量的铁离子由细胞外转入细胞内，导致细胞内的铁超载。

2.2 脂质代谢异常促进缺血性脑卒中患者发生铁死亡

2.2.1 ACSL4可促进缺血性脑卒中患者发生铁死亡 GUBERN等［35］发现，大脑缺血后ACSL4表达升高，并参与缺血再灌注损伤。而ACSL4的过度表达可能是由miR-347控制的，有研究发现，miR-347表达在缺血性脑卒中患者中增加，并在转录后上调了ACSL4水平［28］。特殊蛋白1（specificity protein 1，Sp1）是通过与ACSL4促进子区域结合来促进ACSL4表达的重要转录元件［36-37］。研究发现，在缺血性脑卒中大鼠模型中，抑制ACSL4可以减轻铁死亡，而罗格列酮和siRNA可以有效抑制ACSL4的活性，进而减少铁死亡［28］。然而，该领域的相关研究仍然较少，因此未来应通过更多的研究来揭示ACSL4在缺血性脑卒中患者铁死亡发生中的具体作用机制。

2.2.2 抑制LOX可减少缺血性脑卒中患者铁死亡 LOX是催化PUFA并诱导铁死亡的关键酶［38］。目前研究发现了多种LOX亚型，其中12/15-LOX是一个特殊的亚型，其能够直接氧化含有PUFA的脂质膜，并直接攻击线粒体［39］。JIN等［40］研究发现，12/15-LOX过度表达会导致脑卒中患者神经元死亡和血-脑脊液屏障被破坏，并且使用12/15-LOX抑制剂可以改善神经功能，减轻水肿。此外，KARUPPAGOUNDER等［34］研究发现，5-LOX可以促进脂质过氧化并诱发铁中毒，而含有硫醇的氧化还原剂化合物〔N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）〕可以有效抑制5-LOX的功能，逆转脑损伤并减少神经元死亡。以上研究表明，LOX特别是12/15-LOX是限制脑卒中后脑损伤的一个新的治疗靶点。

2.3 System Xc-失调可促进缺血性脑卒中患者发生铁死亡 GPX4能抑制脂质过氧化，与脑卒中患者发生铁死亡密切相关。ALIM等［41］在缺血性脑卒中大鼠模型中发现，硒可以通过激活转录因子活化蛋白2C（transcription factor activator protein 2C，TFAP2C）和Sp1促进抗氧化剂GPX4的表达，从而抑制铁死亡和保护神经元。有研究发现，GPX4基因表达上调可有效改善脑卒中大鼠继发性脑损伤程度，包括脑水肿和神经元功能障碍程度；相反，敲除GPX4基因会加重脑损伤程度［42］。GSH是细胞内唯一能阻止亚铁离子产生剧毒羟基自由基从而抑制铁死亡的亚铁离子配体，而促进GSH生成有助于减轻缺血性脑卒中大鼠的神经功能损伤程度［43］。研究发现，依达拉奉可以抑制由各种情况引起的铁死亡，尤其是由胱氨酸缺乏引起的GSH含量降低导致的铁死亡，并已被临床批准用于治疗急性缺血性脑卒中［44］。System Xc-作为谷氨酸/半胱氨酸逆向转运体，可产生GSH和GPX4，因此其对抑制铁死亡具有积极作用。缺血性脑卒中发生时，细胞外谷氨酸水平会因谷氨酸摄取量的降低、细胞外囊泡释放量的增加和非囊泡谷氨酸的释放而升高，从而导致谷氨酸中毒［45-46］，进而阻止胱氨酸与谷氨酸交换，抑制GPX4的产生，最终引发铁死亡［47］。然而，System Xc-上调将导致更多的谷氨酸释放和对胶质细胞所产生的兴奋性毒性损害事件。类似的，星形胶质细胞中的System Xc-可以通过调节IL-1β的兴奋性毒性作用来加重脑缺血后的神经损伤［48］。System Xc-的功能障碍可能由其溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）（又称xCT，发挥氨基酸转运作用的亚基）的失活触发。此外，研究发现，缺血性脑卒中大鼠模型中xCT上调可产生持续的谷氨酸兴奋性毒性作用［49］。以上研究表明，当System Xc-的浓度达到一定阈值时，可能会加重谷氨酸兴奋性毒性、增加铁死亡，而不是抑制谷氨酸兴奋性毒性、降低铁死亡，当然，还需要更多的研究来证实System Xc-在缺血性脑卒中患者铁死亡发生中的具体作用机制。

3 中医药通过干预铁死亡治疗缺血性脑卒中相关研究进展

缺血性脑卒中在中医学中属“中风”范畴，中医药在缺血性脑卒中的临床治疗中具有独特的优势，其在抗氧化损伤、抑制钙超载、调节自噬和凋亡、促进血管生成和神经再生方面发挥重要作用［50］。

3.1 电针通过干预铁死亡治疗缺血性脑卒中 电针结合了传统针灸和现代电刺激，在临床上得到了广泛应用，其可以明显改善缺血性脑卒中患者的神经功能和生活质量［51］。电针不仅能提供强大而稳定的刺激，还可以作用于多个靶点。研究表明，电针具有抗凋亡、抑制自噬、抗炎、减轻氧化应激、促进神经干细胞增殖和分化以及神经血管重塑等作用［52-54］。LIANG等［55］发现，电针预处理组大鼠比对照组大鼠脑梗死体积小；Western blotting分析结果显示，再灌注后电针预处理组铁代谢相关蛋白FPN-1表达水平高于对照组；电针预处理组大鼠脑组织中GSH、GPX4表达水平高于对照组，而ROS表达水平低于对照组。以上研究提示电针可以通过调节氧化应激和铁代谢相关蛋白来抑制铁死亡，从而达到改善缺血性脑卒中患者神经功能的目的。

3.2 中药提取物通过干预铁死亡治疗缺血性脑卒中 红花黄色素（saffower yellower，SY）是一种从红花中提取的黄酮类化合物，GUO等［56］采用SY治疗MCAO模型大鼠2周后发现，SY可降低大鼠神经功能缺损评分，减少脑含水量和缩小梗死面积，指出SY可抑制亚铁离子和ROS的积累，降低脑内ACSL4、TFR1、GPX4、铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1，FTH1）表达水平，升高血清GSH、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛水平。说明SY治疗缺血性脑卒中可能与其能减轻炎症和抑制铁死亡有关。香芹酚是一种从牛至中提取出来的萜烯类物质，GUAN等［57］发现其可以通过上调GPX4表达水平来抑制铁死亡，从而保护沙鼠海马神经元免受脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion，IR）损伤，在此过程中，沙鼠脑组织中的脂质过氧化水平降低，学习记忆能力提高。地黄苷A是一种从地黄中提取出来的物质，其对脊髓损伤、血管性痴呆等患者具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的神经保护作用［58］。有研究者对MCAO合并认知障碍模型大鼠以80 mg/kg的剂量腹腔注射地黄苷A，并用生地黄甙A处理24 h后发现，与模型组相比，地黄苷A组大鼠认知障碍和神经功能缺损情况明显减轻，脑梗死体积减小，细胞活力增加，H2O2所诱导的氧化毒性降低，说明地黄苷A的作用机制可能与抑制铁死亡和激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/核因子E2相关因子2（nuclear facter erythroid 2-related facter 2，Nrf2）信号通路和SLC7A11/GPX4信号通路有关［59］。此外，从高良姜中分离出来的黄酮类化合物高良姜素，可通过激活沙鼠体内的SLC7A11和GPX4抑制铁中毒，从而减轻脑IR损伤［60］。

3.3 中药复方通过干预铁死亡治疗缺血性脑卒中 脑泰方为目前治疗缺血性脑卒中的有效中药复方，其能够明显减轻MACO模型大鼠神经元损伤，并可促进大鼠神经功能的恢复［61］。饶政清等［62］使用脑泰方治疗MCAO模型大鼠发现，与对照组相比，试验组大鼠脑梗死体积缩小，神经功能评分降低，脑缺血区尼氏体增多，细胞损伤程度降低，含铁聚集颗粒细胞的数目减少，脑铁、丙二醛及活性氧含量降低，提示脑泰方可以通过抑制TFR1/DMT1信号通路和激活SCL7A11/GPX4信号通路而减少神经元对铁的吸收，从而改善大鼠的神经功能。补阳还五汤具有扩张血管、增加脑血流量、消炎、抗氧化、改善微循环以及抗血栓等作用，其可通过增加血管内皮生长因子、抑制神经元凋亡、抗感染、减少基质金属蛋白酶等多种途径来防治缺血性脑卒中［63-64］。赵冯岩等［65］通过网络药理学推测出补阳还五汤经铁死亡途径调控缺血性脑卒中可能与MAPK、PI3K-Akt等信号通路有关。目前中药复方对缺血性脑卒中患者铁死亡作用的研究仍较少，需要进一步研究证实。

4 小结及展望

铁死亡与缺血性脑卒中密切相关，抑制铁死亡能明显减轻缺血性脑卒中患者的神经损伤程度，提示铁死亡介导了缺血性脑卒中的神经损伤，并且可作为缺血性脑卒中的潜在干预靶点。然而铁死亡发生的确切机制仍不清楚。中医药具有多靶点的优势，在治疗“中风”方面有着悠久的历史，且在患者神经功能的康复中具有重要作用。虽然中医药通过干预与铁死亡相关的通路治疗缺血性脑卒中的研究有限，但从目前的研究中可以发现，电针、中药提取物、中药复方等可通过干预铁死亡治疗缺血性脑卒中，这有助于脑卒中治疗方法的发展。未来还需要开展更多的研究，继续深入挖掘中医适宜技术中的关键靶点环节，为中医药治疗脑卒中提供新思路和新策略。

作者贡献：刘长兴进行文章的构思与设计，撰写论文；郭心怡进行文献/资料整理；郭心怡、张雷雷进行论文修订；常翔进行文章的可行性分析，负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。