TANK结合激酶1在肺动脉高压中的作用机制

刘美洋，孙佳伟，崔志峰，宫小薇，袁雅冬

研究表明，肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）可能影响全球约1%的人口，在65岁以上人群中，PH的患病率已达10%［1］。PH是一种由肺动脉内皮细胞功能障碍、肺动脉平滑肌细胞过度增殖、细胞凋亡异常等引起的复杂疾病，其特征是肺血管阻力增加、血管重塑、血管阻塞，最终导致右心衰竭和死亡［2］。在PH的病理生理过程中，巨噬细胞中损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）相关先天免疫［3］、巨噬细胞代谢以及肺血管系统细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑［4］均发挥重要作用。随着研究的逐步深入，TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）逐渐被大家关注，其是先天免疫的关键酶，同时可参与细胞代谢的调节，亦可参与ECM重塑。因此，本文立足于TBK1，综述TBK1的结构与活化机制、巨噬细胞与PH的关系及TBK1在PH患者巨噬细胞DAMP相关先天免疫、巨噬细胞代谢、肺血管系统ECM重塑中的作用，旨在进一步阐述PH的病理机制，为其治疗提供新的方向与靶点。

1 TBK1的结构与活化机制

1.1 TBK1的结构 TBK1也称为NF-κB激活蛋白（NF-κB- activating kinase，NAK）或T2K，属于IκB激酶（IκB kinase，IKK）家族。TBK1最初被确定为介导TANK激活NF-κB能力的激酶［5］。TBK1是由729个氨基酸组成的蛋白质，包含4个主要结构域，分别为激酶结构域、泛素样结构域（ubiquitin-like domain，ULD）、C末端结构域（C-terminal domain，CTD）和卷曲螺旋结构域（coiled-coil-domain，CCD）（包括CCD1和CCD2）［6］。其中，CCD1和CCD2构成一个α螺旋支架二聚化结构域（α-helical scaffold dimerization domain，SDD）［7］。与经典IKK（IKKα、IKKβ）相比，CCD1和CCD2共享一个ULD，这是最佳激酶活性所必需的，但TBK1结构上缺乏C-末端NF-κB必需调节剂（NF-κB essential modulator，NEMO）结合结构域［8］，因此也就失去了与结构蛋白NEMO结合的可能，NEMO虽然没有催化活性，但却是经典NF-κB活化途径中的必需结构蛋白［9］。NEMO是NF-κB介导的信号传导的关键调节剂，其通过传输细胞外或细胞内信号，控制NF-κB［10］。TBK1信号通路的活化则依赖于其他接头蛋白的参与［11］，如TRAF家族成员相关的NF-κB激动子、NAK相关蛋白1（NAK-associated protrin 1，NAP1）和视神经蛋白［12］。这些接头蛋白的结构及作用模式均类似于NEMO［13］，均与TBK1直接相互作用，形成蛋白酶复合物，进而激活下游蛋白因子。

1.2 TBK1的活化机制 TBK1的活化是由多种方式调节的，如磷酸化、泛素化、激酶活性和防止功能性TBK1复合物的形成［14］等。

1.2.1 磷酸化 TBK1未被激活时以二聚体形式存在，当接收到活化信号时，TBK1发生折叠并开始成簇聚集，使得分子间相互接触而激活激酶活性区，导致第172位丝氨酸发生自磷酸化。磷酸化的TBK1会通过类似正反馈调节的方式，进一步激活更多的TBK1，以达到级联放大的活化效果［15］。TBK1自磷酸化过程受多种激酶及磷酸酶的调控，最早发现的关键激酶是糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β），其可与TBK1结合而辅助TBK1的自磷酸化［16］。Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitory protein，RKIP）则是TBK1激酶的底物，TBK1磷酸化RKIP后，可进一步促进TBK1自磷酸化［17］。同时，第179位酪氨酸的磷酸化对TBK1的激活有促进作用，此过程由酪氨酸激酶Src进行催化［18］。然而，终止TBK1磷酸化则是由多种磷酸酶进行调控的，且去除S172上的磷酸集团后TBK1可恢复未激活状态。其中蛋白磷酸酶4［19］、蛋白磷酸酶1B（protein phosphatase 1B，PPM1B）［20］以及细胞分裂周期25A（cell division cycle 25A，CDC25A）［21］均参与终止TBK1磷酸化的过程。此外，还可通过其他途径间接地终止TBK1磷酸化，如Src蛋白激酶家族成员Lck、Hck及Fgr［22］、糖皮质激素［23］等。

1.2.2 泛素化 除磷酸化/去磷酸化外，泛素化/去泛素化是调节TBK1活化的另一种重要方式。E3泛素连接酶可介导TBK1上的K63连接的多泛素化并促进其活化［24］。E3泛素连接酶中的MIB1、MIB2和Nrdp1通过促进K63连接的多泛素化激活TBK1［25］。研究表明，同时存在的几种去泛素化酶可以通过破坏K63连接的多泛素化来终止TBK1的激活，如肿瘤抑制基因CYLD可去除K63连接的多泛素链［26］，A20调节复合物可拮抗K63-TBK1的连锁多泛素化，该复合物包括泛素编辑酶A20（也称为TNFAIP3）、Tax1结合蛋白1（Tax1 binding protein 1，TAX1BP1）和A20结合的NF-κB抑制物1（A20-binding inhibitor of NF-κB 1，ABIN1）［27-28］。

1.2.3 激酶活性 TBK1为先天免疫中的关键激酶，可以通过调节TBK1激酶的活性来调节其介导的免疫反应。含有Src同源结构域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homology 2 domaincontaining protein tyrosine phosphatase 2，SHP-2）可以不依赖磷酸酶活性来抑制TBK1活性，TBK1激酶的结构域可以直接与SHP-2上的C末端结构域结合，进而抑制其活性及干扰素（interferon，IFN）-β的产生［29］。MCCOY等［23］发现，糖皮质激素地塞米松不仅可抑制TBK1磷酸化，还可以通过抑制其激酶活性来影响其活性。

1.2.4 防止功能性TBK1复合物的形成 功能性TBK1复合物包括含TBK1、IKKε、TRAF3、干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF）3和其他接头分子〔TRIF、线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）或干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING）〕的复合物，其形成对TBK1的活化至关重要。研究发现，MIP-T3可与TRAF3蛋白特异性相互作用，这可能会阻碍功能性TRAF3-TBK1复合物的形成，从而终止IFN-β的激活［30］。SIKE（IKKε抑制因子）可隔离IKKε/TBK1，其可作为IKKε/TBK1的生理抑制因子［31］。研究发现，AVSSTING-TBK1复合物可通过空间位阻的方式特异性破坏干扰素刺激基因56（IFN-stimulated gene 56，ISG56），进而影响免疫反应［32］。

2 巨噬细胞与PH的关系

PH发病机制复杂，受多种因素影响。炎症是PH的标志之一，与其发病机制密切相关。PH不仅可作为各种全身炎症状态的并发症，如红斑狼疮、硬皮病、混合性结缔组织病、桥本甲状腺炎、Castleman病、POEMS综合征、HIV感染和自身免疫性疾病［33］。同时，研究发现，PH患者肺血管病变内可观察到大量巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞等炎症细胞浸润，最终导致肺血管内皮细胞损伤及平滑肌细胞增殖，进而引发肺血管重构，这提示免疫炎症反应参与PH的发生发展［34］。研究表明，巨噬细胞是PH病变血管周围最主要的炎症细胞［35］。巨噬细胞具有高度可塑性，其在炎症不同阶段针对外界信号作出不同反应，并可分化为不同表型，根据其表型和分泌的细胞因子可将其分为经典激活的M1型巨噬细胞和替代激活的M2型巨噬细胞两种亚型，一定条件下二者可相互转化［36］。巨噬细胞M1型/M2型极化失衡可诱发并促进如PH、动脉粥样硬化等多种疾病的进展［37］。其中M1型巨噬细胞可分泌多种促炎因子，如IL-6、IL-12、IL-18、IL-23和TNF-α，并上调CD86、CD80、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、趋化因子（C-X-C基序）配体〔chemokine（C-X-C motif）ligand，CXCL〕9、CXCL10等的表达，防御细胞内病原体的感染，同时也会抑制组织周围的细胞增殖，导致组织损伤；M2型巨噬细胞可分泌抗炎因子如IL-10、IL-1受体拮抗剂，并上调精氨酸酶1（arginase 1，Arg1）、CD206和CD163的表达，从而促进细胞增殖、伤口愈合及组织修复，在炎症后期起重要作用［38］。

3 TBK1在PH患者巨噬细胞DAMP相关先天免疫中的作用

近年来研究发现，消除PH中的关键免疫过程可能逆转血管重塑，进而缓解PH［39］。先天免疫系统是人体抵抗感染的第一道防线，该系统可以通过病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）途径来识别病原体。同时，MATZINGER［40］发现，人体正在使用的与PAMP类似的系统在没有感染的情况下，可发出组织损伤的信号，并将其命名为DAMP。研究发现，PH患者巨噬细胞中可发生DAMP激活以促进肺血管重塑［3］。与PAMP类似，DAMP可被模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别并能够在巨噬细胞中引发免疫反应［41］。PRR主要包括Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）、维甲酸诱导基因Ⅰ（retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ）样受体、核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）样受体和C型凝集素受体［42-43］，这4类受体可以识别脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、病毒RNA、双链DNA（doublestranded DNA，dsDNA）等物质并向下游通路传导信号，进而激活免疫系统并引发炎症反应［44］。MELOCHE等［45］发现，DNA损伤对PH的发展很重要。有研究者在PH动物模型肺和重塑的动脉中均发现了高水平的DNA损伤［46］。在PH患者中，越来越多的证据表明，氧化应激和炎症通过促进血管过度收缩和细胞增殖来促进血管重塑［47-48］，得到公认的是这些因素也可导致DNA损伤［49］。

在先天免疫中，环-磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶（cyclic-GMP-AMP synthas，cGAS）发挥着重要作用［50-51］，其是一种细胞DNA感受器，主要识别dsDNA并激活先天免疫应答［52］。其中TBK1是cGAS信号通路中的关键蛋白，且cGAS-STINGTBK1轴被认为是先天免疫的主要信号通路，与多种疾病密切相关［50-51］。当细胞受到损伤时，dsDNA可释放至细胞质［53］，并与cGAS结合，形成一个2∶2的二聚体结构［54-55］，从而引发活性位点的改变；激活状态的cGAS可将ATP和三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）合成环鸟苷酸-腺苷酸（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP），而cGAMP可以作为第二信使直接激活内质网上的STING；随后，激活的STING从内质网转运到高尔基体中间室和高尔基体［56］，其中高尔基体上激活的STING可招募并激活TBK1，而TBK1又可招募并磷酸化下游IRF3［57］；STING同时可以激活IKK，并磷酸化NF-κB的抑制剂IκB家族；磷酸化的IκB蛋白被泛素-蛋白酶体途径降解［58］，此时NF-κB进入细胞核，并与干扰素调节剂IRF3协同作用，诱导M1型相关炎症因子的表达，从而引起炎症反应及免疫反应。研究发现，在低氧相关PH小鼠病程早期肺泡灌洗液中，M1型相关炎症因子水平升高［59］，且IL-6水平随PH严重程度的加重而升高［60］。因此，在巨噬细胞中，TBK1参与的先天免疫可促进PH的病理变化。

4 TBK1在PH患者巨噬细胞代谢中的作用

细胞代谢稳态需要通过合成代谢过程将营养物质（如葡萄糖和氨基酸）和能量（ATP）协调转化为大分子物质（如蛋白质、核酸和脂质），并将这些大分子物质再循环回其营养成分，从而进一步分解代谢，产生能量。随着营养物质的不断输入，这种营养物质和大分子物质的相互转化理论上可以自我维持。然而，细胞和有机体拥有不同的系统来感知营养和能量的波动，从而使其代谢状态适应营养供应或消耗［61］。巨噬细胞的极化方向与能量代谢方式密切相关，而PH患者巨噬细胞代谢变化主要包括糖酵解、脂肪酸氧化等。

4.1 糖酵解 Warburg效应最初是在癌症中定义的，指在正常氧浓度条件下葡萄糖最终产生乳酸［62］。COTTRILL等［63］发现，在许多情况下，Warburg效应是PH的主要致病机制。1970年，HARD［62］首次发现活化的巨噬细胞中糖酵解水平上升，同时氧化磷酸化及ATP水平明显降低，表现出类似肿瘤细胞的Warburg效应。研究发现，M1型巨噬细胞主要以有氧糖酵解及戊糖磷酸途径来提供能量，M2型巨噬细胞主要以氧化磷酸化及脂肪酸氧化来提供能量［36］。mTORC1是一种营养感应蛋白激酶，是细胞代谢的主要调节剂，其被激活时可促进生物合成过程，其还可诱导糖酵解和谷氨酰胺分解过程以进一步支持合成代谢功能。DÜVEL等［64］发现，mTORC1可以刺激糖酵解途径，这是通过激活影响缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α和甾醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding proteins，SREBP）1和SREBP2的代谢基因靶标的转录程序来实现的。BODUR等［65］在细胞实验中发现，TBK1可以与mTOR上特异性位点（在S2159上）结合并激活mTORC1，首次证明了TBK1可直接激活mTORC1。总之，TBK1可能通过mTORC1来影响糖酵解，进而影响巨噬细胞极化，参与PH的形成。

4.2 脂肪酸氧化 脂质是巨噬细胞极化过程中的关键代谢物。M1型巨噬细胞合成脂肪酸并将其用作合成炎症递质的前体，同时从有氧糖酵解中获得大部分ATP，而M2型巨噬细胞具有由脂肪酸氧化驱动的功能性线粒体呼吸链。脂肪酸代谢包括多个步骤，如细胞脂肪酸摄取和储存、脂肪酸转运到线粒体、线粒体脂肪酸β-氧化和脂肪酸合成等。研究显示，PH患者的心脏和肺脏中存在脂肪酸代谢失衡［66-67］。2018年的一项研究发现，在高脂饮食小鼠的正常脂肪细胞中，TBK1的表达和活化水平增加，而特异性敲除脂肪细胞中TBK1后小鼠对高脂饮食诱导的肥胖具有抵抗性［68］。总之，TBK1对PH患者巨噬细胞中的脂肪酸氧化可能有一定影响，但其具体机制有待进一步研究。

5 TBK1在PH患者肺血管系统ECM重塑中的作用

越来越多的证据表明，肺动脉ECM重塑导致的肺动脉顺应性降低在PH发病中起关键作用［4］。研究发现，PH大鼠表现出典型的NF-κB活性增加，同时伴有右心室肥厚和右心功能障碍，而给予非选择性NF-κB抑制剂可以改善这种状况［69］。这可能与ECM重塑有关，PH患者的ECM重塑可归因于内皮-间充质转分化（endothelial-mesenchymal transition，EndoMT），其中内皮细胞可获得间充质表型，其基因谱表达增加，类似于平滑肌细胞［70］。通常与PH发病机制有关的各种因素会引发EndoMT，如慢性缺氧导致的转录因子Snail、Twist、信号转导、活化转录因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）、NF-κB、IRF1和β-catenin表达增加，这些转录因子通过与HIF和TGF-β信号传导相互作用来引发EndoMT［70-71］。同时研究发现，在PH动物模型及内皮细胞模型中，NF-κB家族成员（如NF-κB1、NF-κB2、P65和RelB）的DNA结合活性均增加［72］。TBK1中的CCD2可与TANK、NAP1及与NAP1类似的TBK1接头蛋白（similar to NAP1 TBK1 adaptor，SINTBAD）相结合，进而共同调控NF-κB信号通路的活化［73］。TBK1同时可以与NAP1直接相互作用，进而活化NF-κB信号通路［74］。综上，在PH患者中，TBK1可通过活化NF-κB信号通路来影响EndoMT，进而导致肺血管系统ECM重塑。

6 小结及展望

PH存在病情进展迅速、致死率高、预后较差的特点，目前被称为心血管疾病中的“恶性肿瘤”。当前治疗药物并不能逆转已发生的肺血管系统ECM重塑，只能延缓PH的病情进展，且患者的长期预后依旧不容乐观。TBK1参与的巨噬细胞中DAMP相关先天免疫、代谢异常及肺血管系统ECM重塑在PH病理过程中发挥了重要作用，抑制TBK1可有效缓解PH，进一步明确TBK1在PH发展过程中的分子机制可为治疗PH提供新的思路。

作者贡献：刘美洋进行文献资料的收集和分析，撰写、修订论文；孙佳伟、崔志峰进行文献资料的分析、整理；宫小薇、袁雅冬进行文章的构思与设计，负责文章的质量控制和审校；袁雅冬对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。