miRNAs在肝细胞癌中的作用及其机制的研究进展

徐红艳 张守华 黄 慧 雷 俊 综述 梅金红 审校

小分子RNA(microRNA，miRNA)被称为微小RNA，目前已经在自然界中的哺乳动物、植物以及线虫等真核生物中鉴定发现超过千种miRNAs[1]。微小RNA作为一类长度在19～22个核苷酸大小内源性非编码的一组遗传基因，其作用主要是通过与下游靶基因信使脱氧核糖核酸(mRNA)碱基进行配对从而抑制转录或阻碍蛋白翻译过程，并在转录后水平起到对靶基因表达的有效控制。相关研究资料显示，在人类基因组中，有接近1/3为微小RNA的靶基因[2]。而在最新的研究中，提示这类遗传因子可能通过全方位、多层次的网络系统而扮演着在基因表达调控过程中的分子开关角色，并且同动植物的一系列生理学和病理学过程紧密相关，诸如胚胎发育、器官生长、细胞的增殖、分化、自噬和凋亡、免疫应答以及脂肪代谢等生命活动[3]。既往大量研究表明，miRNAs的异常表达在肿瘤的形成和进展过程中起到了十分关键的作用，其中诸多miRNAs在某些类型肿瘤中体现了表达特异性，因此为临床肿瘤患者接受有效的靶向治疗提供了机会[4]。

1 miRNAs生物学特点

1.1 结构及合成

据推测多数已鉴定的miRNAs具有发夹结构，miRNA的合成初始步骤为发生于细胞核中的多级式反应过程[5]。在细胞核中，约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA最初由核糖核酸聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下转录形成初级miRNA(Pri-miRNA)，其在受到酶-蛋白复合体(Drosha酶-DGCR8)的作用下，形成长度71～85个核苷酸大小的含缺陷茎环结构的前体miRNA(Pre-miRNA)。随后该pre-miRNA在Ran/GTP及Exportin-5的辅助作用下向胞质转移，到达胞质后的pre-miRNA由Dicer酶剪切为大约22个核苷酸长度的双链miRNA，这阵双链微小RNA中一条单链可选择性的同RISC(RNA-induced silencing complex)发生结合，最后形成成熟的微小RNA分子，发挥调控细胞生物学功能的作用[6]。

1.2 生物学功能

从物种进化角度分析，微小RNA显示出了高度保守性，这意味着miRNAs在细胞的各项功能活动中起到了十分重要的调控作用。miRNA同RISC的结合过程，可通过与下游靶基因发生互补或非完全互补方式的识别和结合，通过RNA干扰途径导致基因表达沉默，或引起靶基因mRNA直接发生裂解或阻抑蛋白的翻译过程，由转录后水平调节基因的表达[7]。基因表达受到miRNA所节制，多个基因可受到某一种miRNA的调控作用，而同一个靶基因的表达可受到多个miRNA的组合调控而实现精密调控[8]。尽管目前已经认识鉴定了人类超过几百个miRNA基因，随着近年来计算机信息技术的发展，经过精密的推算，在人类基因组中有超过1000个微小RNA，其中有某一个微小RNA能够调节超过200个下游靶基因，并且有接近30%的蛋白编码基因的表达受到miRNA所调节。这些研究均显示出这类遗传因子在基因表达调节领域所扮演的关键角色。国际上大量科学实验证实[9]，miRNAs往往存在于这些生物细胞染色体的相关脆性位点或出现杂合子缺失，并参与到调控组织细胞的各项生物学活动中，包括细胞的增殖、分化及凋亡活动，并且被证实同人类恶性肿瘤、糖尿病、关节炎以及红斑狼疮等疾病的发生和发展紧密相关，但是miRNA在这些疾病中所发挥的作用及具体分子机制仍不明确。

1.3 失调分子机制

既往miRNA与肿瘤性疾病发生发展的相关性研究能够清晰阐明miRNAs表达失调相关分子机制，对人类认识肿瘤的起病和发展的具体过程、提升肿瘤的诊断水平以及找到更加高效的治疗靶点等有重要的意义。研究证据表明[10]，微小RNA表达失调的因素多种多样，归纳其主要原因包括：基因转位、DNA甲基化、基因扩增、癌性转录因子活化、低氧状态、miRNA点突变或基因多态化以及致癌病毒蛋白产物等。

2 miRNAs在HCC发生发展中的作用机制

2.1 miRNAs与肝癌的发生

肝癌作为一种原发于人类肝脏的恶性肿瘤，其发病因素较多，最常见的因素有长期过度饮酒、病毒性肝炎、食用霉变食物以及遗传因素等[11]。大量分子生物学研究表明，微小RNA同肝细胞癌的发病关系紧密，具体可能同多个不同癌基因、抑癌基因及其相应产物表达和结构异常改变有关，miRNA在其中不仅可扮演癌基因发挥致癌作用，还可参与到抑癌基因相关途径发挥抗癌作用[12]。国外的相关研究分别对肝癌细胞和正常肝细胞中的189个miRNAs分子表达情况进行检测分析，结果发现，相比于正常肝细胞中miR-221表达水平，肝癌组织中表达明显增高，接近正常肝细胞的9倍[13]。值得引起注意的是，当肝细胞中miR-221表达水平增高时，可引起PTEN基因蛋白表达减少，提示miR-221的靶向目标分子可能为PTEN。而在相关研究中[14]，高水平表达的miR-221可起到对PTEN基因翻译过程的抑制作用，该基因表达受阻可触发一系列细胞多种生物学行为，包括增殖活动、远端转移以及侵袭浸润等，由此推测miR-221可能在肝细胞癌的起病和发展过程中起到了始动效应。国外相关研究中[15]，某课题组应用致癌药Tamoxifen对大鼠进行饲喂若干周后，诱导获得肝癌大鼠模型，分别在12周和24周检测荷瘤老鼠肝脏组织细胞中miRNAs表达谱，发现同正常对照组相比，肝癌组大鼠中有34个(21个表达增加，13个下调)miRNAs呈异常差异化表达，其中部分被视为癌基因的miRNAs均呈现明显过表达[16]，包括miR-16、miR-21、miR-17-5p、miR-20b、miR-34、miR-106a以及miR-146a等。同时研究还发现这些miRNAs所对应的Bcl-2、Notch1、E2F1以及RB1等多个下游靶基因蛋白的表达呈显著下调趋势，而这些活性蛋白对细胞周期进展、细胞凋亡、染色质修饰、DNA复制及肿瘤的发生发展过程中均有重要影响。除了上述几种miRNAs外[17]，还检测到包括miR-18、miR-31、miR-25、miR-15a、miR-193、miR-345、miR-193、miR-375在内的16个miRNAs表达上调，同时还检测到包括miR-27a、miR-28、miR-361、miR-195、miR-350、miR-203以及miR-191在内的14个miRNAs表达下调，同时指出miRNA的异常差异化表达开始于肿瘤形成的初始阶段，是一类在评估肿瘤形成过程的重要潜在生物学标志物，可为肝癌的预防、诊断和靶向治疗提供重要依据。

2.2 miRNAs与肝细胞癌分化

国外研究学者对入院治疗的28例肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)、24例HCC周边正常组织(Normal tissue，NT)及11例慢性肝炎(Chronic hepatitis，CH)进行粗针穿刺后，通过芯片技术检测分析其miRNAs表达谱，结果发现HCC组同NT组相比，一共有32个miRNAs存在明显差异[18]。研究表明，相对于NT组检测结果，HCC组表达呈现出显著增高的miRNA共有3个：分别为miR-18、miR-224及pre-miR-18，存在显著下调的一共有5个：分别为miR-125a、miR-192-3p、miR-165a、miR-222和miR-200a[19]。进一步研究发现同HCC分化程度存在一定相关性的miRNAs有3个：分别为miR-18、miR-92、pre-miR-18，这些异常因子的表达量在分化差的HCC组织中最高，在分化好的HCC组织中处于低水平[20]；而miR-92的实际表达量同癌细胞的分化程度呈现出显著的正相关性。由此认为，miR-18可能在HCC的发生和分化成熟过程中发挥着重要调节作用。此外，研究人员对入院患者中16例肝硬化(Liver cirrhosis，LC)和14例CH样本进行分析，结果一共找到14个miRNAs呈现出明显的表达差异，其中LC组的miR-28、miR-143、miR-126、miR-199a以及miR-145b等8个表达明显高于CH组；而miR-182、miR-15b以及miR-224等6个较CH组表达明显降低。而在对入选HCC患者的病因学分析中[21]，研究组发现伴HBV或HCV感染的HCC组miRNAs表达谱之间并不存在统计学差异。国外某课题组进行的大鼠对照研究中，应用含246种不同miRNAs的芯片分别对正常大鼠肝脏和叶酸、甲基、胆碱缺乏性大鼠肝肿瘤模型的微小RNA表达情况进行检测分析，结果在肿瘤组中一共发现了26种表达增加，3个表达下调。在临床实验中[22]，研究者应用miRNA芯片检测42例肝细胞癌组织中的微小RNA表达情况，发现有6种表达超过正常组两倍，分别为miR-23a、miR-24、miR-130、miR-130a、miR-328-1和miR-219-1；在所有肿瘤样本中仅miR-22表达降低50%，部分miRNA在不同组织样本中降低程度不一致，如miR-123和miR-235等。国内临床研究报道中[23]，有学者对24例肝细胞癌组织进行测定分析，结果发现同癌周肝组织相比较，12例肝癌样本中的miR-122表现出显著降低趋势，在人、大鼠及小鼠的HepG2、H4及H7等多个肝癌细胞系中均呈现为低表达或不表达。有证据提示[24]，miR-122是肝脏发育过程具有关键调节作用的“肝特异性miRNA”，对肝脏器官的发育、分化和结构功能维持有重要作用。在细胞学研究中，在大鼠母体置入受精卵后约13天则可在其体内检测到miR-122的表达；在大量肿瘤相关实验中同样检测到miR-122的异常过表达现象，包括肝腺瘤及肝细胞局部结节性增生等[25]。值得关注的是，一些微小RNA的表达与肝脏恶性肿瘤有关危险因素存在一定关联，以miR-96为例，其表达变化被证实同乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染后出现的肝细胞癌密切相关；miR-126同酒精性肝细胞癌的发生密切相关[26]。与此同时，近年来开展的相关研究大多侧重于miRNA对mRNA功能的调节方面，但微小RNA的自身表达和功能发挥同时受到其他相关因素影响的研究尚不多见。

2.3 miRNAs与肝细胞癌侵袭及转移

miRNAs的异常差异化表达还同恶性肿瘤细胞的转移和侵袭性有关。研究资料表明[27]，导致临床中肝癌患者死亡的最主要原因是恶性肿瘤发生转移和术后复发，因此相关领域研究专家致力于探索某些特定miRNAs表达水平同肝细胞癌远端转移和侵袭性之间的关联。国外某研究小组[28]在收集获得的452个HCC癌性样本(分为侵袭性样本和非侵袭性肿瘤组织样本)和260个非癌性样本(仅为非侵袭性肿瘤样本)后，应用RNA芯片miRNA表达谱进行检测分析，结果发现有20种可以作为同肿瘤转移相关分子生物学标志物，可用于原发性HCC的预测评估，主要包括miR-1-2、miR-194、miR-9-2、miR-207、miR-34a、miR-48b等。但在与之相对应的非癌性组织样本中并未检测到这些miRNAs的表达。这些在癌性样本中的肿瘤生物学标志物显示出了与临床中原发性肝癌患者存活时间及手术治疗后复发风险的紧密相关性[29]。miRNAs的表达模式可为研究者鉴定肿瘤及其侵袭转移性提供更为简单的方式方法。国内某课题组的研究中[30]，研究人员应用含有145个miRNA的液相芯片和Luminex100检测系统对20个HCC样本和20个NT组织进行检测分析，实验结果发现在其miRNAs表达谱中有32个呈差异化表达，其中24个表达下调，8个表达上调；在其入选所有样本中，表现为共存性异常表达的共10个，其中有2个表达上调，即miR-222和miR-224，呈下调趋势的6个：miR-122a、miR-200a、miR-195、miR-182、miR-15b及miR-199a-3p。选择呈过表达的miR-224及其预测靶基因结缔组织生长因子(CTGF)于两个样本采用Wetern blot 和RT-PCR进行验证分析[31]，结果其CTGF中的mRNA表达水平在HCC及NC组织并不存在差异性，但蛋白水平在原发性肝癌组显著降低，推测miR-224是通过转录后基因沉默机制而对CTGF蛋白的表达起到了阻抑效应，最终促进了癌远端转移和浸润侵袭。

3 miRNAs在肝细胞癌中的潜在治疗作用

基于miRNA在肿瘤中的重要价值潜力，研究专家们长期致力于miRNA治疗肿瘤疾病的研究中。目前此方面的策略主要包括两个途径，第一种通过干预使肿瘤中miRNA表达下调，通过转染pre-miRNA而起到对相应miRNA表达的纠正性作用，从而达到控制肿瘤细胞异常增殖和(或)促凋亡目的。如同pre-let-7进行干预可发挥抗肺癌细胞株A549增殖作用；第二种策略是利用反义技术使过度表达的miRNA下调。在国外相关报道中[32]，研究者通过将已经修饰的反义RNA转入至大鼠体内，结果检测到包括肝脏在内多种器官的miR-122、miR-194及miR-16表达水平均明显降低。近期研究表明，miR-122在肝脏发育过程中呈特异性表达。在动物实验中[33]，采用miR-122反义寡核苷酸进行干预后，可观察到其明显的肝功能改变，如胆固醇的合成水平显著降低，提示该微小RNA对于肝功能维持正常有重要意义。在肝癌细胞株MHCC97的体外培养实验中，发现miR-122a具有调控细胞周期蛋白(Cyclin G1)表达作用，在HCC中二者表达趋势显示出明显的负相关，提示Cyclin G1可能为miR-122a的作用靶点之一[34]。而Cyclin G1同人类基因组的不稳定性紧密相关，并在人乳腺癌等多种恶性肿瘤中均呈现异常过表达。国内有关报道[35]，指出Stathmin1为miR-223下游的一个作用靶点。Stathmin为一种主要的微管不稳定蛋白，可通过磷酸化和去磷酸化作用间接控制细胞周期作用。大量肿瘤基因学实验表明[36]，该蛋白的在肿瘤的发生发展过程中存在异常过表达现象，通过干预抑制其表达后可起到一定的抗肿瘤增殖和转移作用。以上研究结论均提示我们，采取一定措施干预HCC发生发展相关的某些“原癌基因”或“抑癌基因”的miRNAs表达，有望为今后实现肝细胞癌病患接受更加有效的基因靶向治疗奠定基础。

基于近年来国内外有关miRNA参与肿瘤进展的相关研究，其作用已经得到广泛证实，但其表达失调与肿瘤发生过程的具体机制仍然有待进一步的研究。目前的研究，已经对转录异常、基因突变、miRNA生物合成过程中关键酶缺陷、表观遗传型改变以及DNA拷贝异常等多种调节机制有了初步认识。在肿瘤的诊断中，目前miRNA的应用仍然存在一定局限性，如通过小样本、单中心的检查来获得差异性标志物，不能通过大样本人群进行筛选和验证，其敏感性和特异性结果存在较大差异。目前miRNA在肝脏恶性肿瘤领域的研究尚不成熟，在治疗方面仍然处于体外细胞学研究和动物实验阶段，某些miRNA类似物及antagomiRNA是否安全和有效性还有待评估验证。将miRNA用作为肝癌诊断、治疗及预后评估的标志物仍需克服诸多问题[37]。