一种亲核加成的硫醇类荧光探针的制备及检测应用

许亚杰，徐金玉，王金，任君

(湖北大学化学化工学院，湖北 武汉 430062)

0 引言

生物体中小分子生物硫醇主要有三种：高亮半光氨酸(Hcy)、半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)[1-4].其中，GSH参与生物体内的许多生物化学过程，包括：免疫调节、氧化应激、耐药性、解毒以及基因调节等[5-9].Cys在生物细胞中浓度异常时，可影响婴幼儿的生长状况，有时候也会导致成年人骨骼肌异常发展，甚至引发体内一些毒症的发生[10-14].Cys也具有防止生物体衰老的功能.因此，实现对Cys和GSH的有效检测，可以有效地对一些疾病进行早期诊断和后期指导治疗.

基于荧光探针的检测方法，可以实现对生物体的无损侵入，在此方面具有多种先天优势，然而，目前已报道的Cys和GSH类荧光探针与生物硫醇反应时，均需要较长时间(超过30 min)，荧光信号强度才会达到峰值[9,15]，而荧光探针发射信号随着时间推移往往会出现一些不可避免的衰减或增强.如何快速地实现荧光信号的变化，是检测硫醇面临的难题之一.

基于此，本研究试图开发一种以萘酰亚胺为母体，烯酮式异构体形成的氢键作为识别位点的新型荧光探针Na-1，并探究了探针Na-1对生物硫醇的响应效果.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器试剂：4-溴-1,8-萘酰亚酐(98%)、正丁胺(99%)、2-醛基噻吩-5-硼酸(98%)、四(三苯基膦)钯(99%,Pd 9%)、碳酸钾(99%)、邻羟基苯乙酮(98%)、哌啶(99.0%)、乙腈(99.9%)、乙醇(99.9%).仪器：WIPM 核磁共振波谱仪(中国科学院400 MHz) 和 Varian UNITY INOVA，LS-55荧光分光光度计 (美国Perkin-Elmer);1260-6224 LC-MS TOF(安捷伦液相色谱质谱联用测试仪).

1.2 化合物Na-N的合成如图1所示，将1-氨基丁烷(1.30 g,18.00 mmol)和4-溴-1,8-萘酐(2.50 g,9.00 mmol)溶于50 mL乙醇中回流过夜.冷却至室温后，过滤得到黄色固体，经柱层析纯化(洗脱液:V二氯甲烷∶V石油醚= 1∶1)，得到2.61 g白色固体，产率:87%.

图1 化合物Na-N的合成方案

1.3 化合物Na-CHO的合成如图2所示，在氮气保护下依次将化合物Na-N (0.83 g,2.50 mmol)、四三苯基膦钯(0.01 g，0.08 mmol)溶解于15 mL甲苯，室温下搅拌30 min，加入2-醛基噻吩-5-硼酸(0.78 g,5 mmol，15 mL无水乙醇溶解),6 mL碳酸钾溶液(2 mol/L)，室温下继续搅拌10 min，升温至83 ℃，回流12 h，冷却至室温，撤去氮气保护，旋干，VPE∶VEA=5∶1过柱分离即可得到0.64 g化合物Na-CHO，产率：70%.

1.4 探针Na-1的合成如图3所示，氮气保护下，将化合物1(0.44 g，1.2 mmol)加入15 mL乙腈溶液中，室温下搅拌15 min，待溶液澄清后加入邻羟基苯乙酮(0.14 g，1 mmol)，并加入3滴哌啶，升温至82 ℃，回流12 h,冷却至室温，撤去氮气保护，旋干，VPE∶VEA=10∶1过柱分离即可得到0.27 g探针Na-1.产率：55%.1H NMR (400 MHz,CDCl3)δ:12.82 (s,1H),8.69～8.63 (m,3H),8.09 (d,J= 16.00 Hz,1H),7.91～7.80 (m,3H),7.55～7.50 (m,3H),7.37 (d,J= 4.00 Hz,1H),7.06～6.94 (m,2H),4.21 (t,J= 8.00 Hz,2H),1.78～1.70 (m,2H),1.51～1.41 (m,2H),0.99 (t,J= 8.00 Hz,3H).13C NMR:(400 MHz,DMSO-d6)δ:192.98,163.74,163.44,161.90,143.42,142.18,137.67,137.05,136.66,132.11,131.56,131.50,131.16,130.71,129.23,129.16,128.61,128.59,123.08,122.56,121.95,121.49,119.71,118.15,93.23,55.58,31.59,30.07,29.43,20.25,14.18.HR-MS(ESI):Calcd for C29H24NO4S m/z[M-H]+482.150 4,Found 482.141 7.

图2 化合物Na-CHO的合成方案

图3 探针Na-1的合成方案

2 结果与讨论

2.1 探针Na-1的紫外与荧光光谱分析在含有10 μmol/L Na-1的CH3CN-PBS(体积比为1∶1；pH=7.26)体系中加入Cys.如图4所示，Na-1的紫外吸收明显增强，且发生微弱的红移.同样的，在同等条件下溶液中加入GSH后与加入Cys的趋势类似对应的Na-1在体系中有较强荧光发射.随着Cys的逐渐加入，观察到明显的“On-Off”现象.且其荧光变化幅度与Cys的浓度相关.而研究表明，GSH也可以得到相同的结论.不同的是，对于Hcy，即使加入50 μmol/L(生物体内浓度为20～30 μmol/L),体系的荧光强度变化也很弱，基本可忽略不计，所以后续研究中我们没有关注Hcy对探针Na-1的影响.

图4 探针Na-1的紫外与荧光光谱分析

2.2 探针Na-1与Cys、GSH的响应分析为了更好地了解探针Na-1检测Cys和GSH的荧光性能，我们对Na-1与Cys和GSH反应时溶液荧光强度随时间变化进行了研究.如图5所示，首先我们研究了探针与Cys反应随时间变化的关系.在Na-1中加入Cys，能观察到明显的“On-Off”现象，且溶液的荧光强度在30 s内达到平衡.同样条件下，探针Na-1对于GSH的检测在30 s之内也能达到平衡.然后，我们进一步探索了探针定量检测Cys的能力.当Cys浓度较低时，溶液的荧光发射强度Cys的浓度成一维线性关系，相关关系为：y=-0.815 69 [Cys] + 531.815 61.根据IUPAC(DL=3σ/K)所得，探针Na-1对Cys的检出限为95 nmol/L,体系荧光强度与GSH的浓度关系为：y=-0.836 614[GSH]+517.213 71，检出限为105 nmol/L.

图5 探针Na-1与Cys、GSH响应分析

2.3 探针Na-1的稳定性我们探索了不同pH体系中Na-1与Cys的反应程度.如图6所示，在CH3CN-PBS(体积比为1∶1；pH=7.26)中加入探针Na-1，溶液pH介于7～8之间，Na-1与Cys反应后,荧光明显下降;同样的，探针Na-1与GSH反应也能达到类似的结果.这意味着，Na-1稳定性较好，适用于检测Cys和GSH.

为了研究探针Na-1检测生物硫醇的适用温度环境，我们探究了不同温度下探针Na-1对Cys和GSH的检测能力.探针Na-1 20 ℃～40 ℃与生物硫醇反应后荧光光谱，随着温度的升高，其荧光强度变化可忽略不计.说明探针Na-1对温度变化也不敏感.

2.4 探针Na-1的选择性如图7所示，在进行选择性分析前，我们在裸眼下观察了探针Na-1对各种氨基酸的识别能力.首先取12份等体积的探针Na-1的CH3CN-PBS(体积比为1∶1；pH=7.26)溶液,分别加入13种等体积的氨基酸(Ala、Arg、Glu、His、Met、Pro、Try、Leu、Rac、Thr、NaHS、GSH、Cys)溶液(CH3CN-PBS的体积比为1∶2)，在日光灯下裸眼观察.发现加入GSH和Cys的溶液颜色发生了变化；同时在365 nm紫外灯下也可以观察到溶液荧光明显猝灭，而其他氨基酸对探针溶液的荧光并没有明显影响.表明在裸眼条件下也能观察到探针分子Na-1对Cys和GSH的检测.最后，我们研究了Na-1对Cys和GSH、NaHS、Ala、Glu、His、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr在CH3CN-PBS(体积比为1∶1，pH=7.26)体系中的荧光强度变化.GSH和Cys能够使得溶液的荧光降低，而其他氨基酸对溶液荧光强度影响可忽略不计.因此，探针Na-1对Cys和GSH具有较好的选择性.

图6 探针Na-1的稳定性分析

图7 探针Na-1的选择性分析

图8 探针Na-1识别Cys、GSH机理探究

3 探针识别机理分析

为了对探针C-1识别生物硫醇的机理进行研究.我们将Cys和GSH加入探针溶液中然后利用质谱表征.图8高分辨质谱表明，在615和787附近出现新峰.我们推测该峰分别是探针与Cys、GSH加成后的碎片峰(探针分子Na-1与Cys、GSH加成的相对分子质量分别为615，787)，该结果验证了探针Na-1与Cys、GSH的识别作用是基于不饱和酮识别机理.

4 结论

我们利用萘酰亚胺的良好发光性能作为荧光团，以不饱和酮作为硫醇的识别位点合成了一种新型探针分子Na-1.经体外光化学和光物理测试分析证实，探针Na-1对GSH和Cys有良好的识别效果，而且其对Cys和GSH的响应快(时间极短，只需要30 s)，优越于一般的硫醇类探针(超过30 min)，有较好的应用前景.