尕海湿地区沼泽草甸土壤酶活性对短期增温施氮的响应

杨永凯， 马维伟， 陈 好， 韦昌林， 杜佳囝， 刘 昊

(甘肃农业大学林学院， 甘肃 兰州 730070)

近几十年以来，全球由气候变暖和氮沉降所导致的一系列生态问题备受科学家关注[1]。近50年来，青藏高原的温度每10年内将升高0.05℃，升温幅度已经远超了全球范围内的平均升温幅度[2]。与此同时，化石燃料的广泛使用、化学氮肥过度利用和畜牧业扩张导致了大气氮沉降的显著增加，预计到2050年将增至270 Tg·a-1[3-4]。尽管青藏高原平均氮沉降水平相对较低，但该区的氮沉降也在持续增加，已达到10～15 kg·N·hm-2·a-1[5]。气候变暖和大气氮沉降会通过改变植被生产力、土壤温度、pH值等环境因子来影响土壤微生物群落结构与活性，从而引起土壤生态系统的养分循环和能量流动的变化。在这些过程中，土壤微生物成为了环境因素与养分循环之间的桥梁。

土壤酶是土壤的组成成分之一，具有特殊的催化能力，一定程度上能反映土壤微生物的活性，指示土壤养分能力的强弱[6]。其中，脲酶能催化尿素生成氨、二氧化碳和水；蔗糖酶能水解蔗糖生成果糖和葡萄糖；磷酸酶可在不同pH条件下水解磷酸生成正磷酸盐；硝酸还原酶能催化土壤中的硝态氮还原成氨，而亚硝酸还原酶能催化土壤中的亚硝酸盐经由羟氨转变为氢氧化铵[7]。一般来说，增温在提高土壤酶活性的同时，也会直接或间接促进植物根系和残体的分解，改善土壤养分的同时也会增加土壤酶分解的基质，进一步提高土壤酶活性的大小[8-9]。然而，不同研究区域中土壤酶活性对增温的响应有所不同。长江口湿地[10]和杭州湾湿地[11]的研究表明，增温能够显著增加土壤脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性；而在内蒙古典型草原[12]的研究发现，增温显著降低了土壤蔗糖酶活性；与此同时，一些在高寒地区研究表明土壤酶活性对增温无响应[13]。因此，不同生态系统或区域的碳氮底物浓度存在一定差异，可能导致同一土壤酶活性对增温响应不同，而不同酶活性本身存在差异，对增温的敏感性也不尽相同。在草地生态系统中，氮素不仅是植物生长发育过程中需求量最大的营养元素，也是植物生长、生物合成以及光合作用的重要限制因子[14]。施氮能够增加土壤可利用氮素底物浓度，进而提高水解酶的活性而降低氧化酶活性[15]。由此推测土壤酶活性可能受到土壤氮素含量和温度变化的交互作用影响较大，但目前关于青藏高原沼泽草甸湿地土壤酶活性响应增温和施氮交互作用的研究较缺乏。因此，研究模拟气候变暖(增温)及氮沉降(施氮)对青藏高原湿地微生物活性的影响，对于深入理解未来气候变化和氮沉降加剧背景下的高寒湿地养分循环具有重要意义。

高寒沼泽草甸在青藏高原的分布面积为5×104km2，是青藏高原典型湿地生态系统之一[16]。近几十年来，放牧活动的加强和大规模气候变化导致青藏高原高寒草甸植被和土壤退化加速[17]，高寒沼泽草甸生态系统的结构和功能正在发生显著改变，在此背景下土壤酶活性将发生何种变化并不明确。为此，本研究以分布在青藏高原东北缘尕海湿地区的沼泽草甸为研究对象，通过对增温、施氮与增温和施氮交互处理下的土壤酶活性测定，以期探究以下问题：未来气候变暖和氮沉降将对高寒沼泽草甸土壤酶活性具有怎样的影响？两个因素之间是否存在交互效应？本研究结果将为预测该地区在气候变暖和大气氮沉降持续增加背景下湿地土壤养分循环的响应提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

尕海湿地位于甘肃省甘南藏族自治州国家级自然保护区内，地理坐标为33°58′12″～34°32′16″N，102°05′00″～102°47′39″E，海拔3 430～4 300 m，保护区内湿地面积57 846 hm2，其中沼泽草甸51 160 hm2，湿地面积中约80%为高寒沼泽草甸，主要分布在河谷底、湖畔、积水的滩地和洼地。该地区年均气温1.2℃，年平均日较差13.7℃，气温以7月份最高，平均为10.5℃；1月份最低，平均为—9.2℃，年均降水量781.8 mm，降雨通常集中在7—9月，年蒸发量1 150.5 mm[18-19]。主要植物有藏蒿草(Kobresiatibetica)、密毛白莲蒿(Artemisiasacrorum)、甘藏苔草(Carexmoorcroftii)、蕨麻(Potentillaanserina)、冷蒿(ArtemisiafrigidaWilld)、珠芽蓼(Polygonumviviparum)等[20]。土壤类型主要为暗色草甸土、泥炭土和沼泽土等。

1.2 样地设置

2021年5月，以尕海湖周边的典型沼泽草甸为研究对象，随机选取植被生长均匀、群落盖度在85.0%以上的区域，采用野外控制试验的方法，以自然生长小区为对照(CK)，同时布设增温(T)、施氮(N)和增温+施氮(TN)处理，每个处理3次重复，共计12个试验小区，各小区面积约为2.2 m2(边长为92 cm的正六边形)，小区间隔离带宽5 m以上。增温设备采用被动增温的开顶箱(Open-top chamber,OTC)法，被动增温箱依据ITEX(International Tundra Experiment)进行设计[21]。开顶箱采用6块梯形状的透明有机玻璃，围成向内倾斜的正六边形，边长为92 cm，开顶箱高61 cm。设置时间为2021年5月。施氮根据青藏高原氮沉降背景值(10 kg·hm-2·a-1)的1.5倍(约为15 kg·hm-2·a-1)进行添加处理[5]。选择植物易吸收的NH4NO3作为氮添加肥料，将4.97 g NH4NO3溶解于2 L水中，然后在5月、7月中旬分2次采用喷雾器均匀的喷洒到样方中，对照和无添加的样方采用同样体积水(2 L)进行喷洒处理。

1.3 土壤样品采集与温湿度测定

于2021年8月底进行土壤采样(样品中添加氮为15 kg·hm-2·a-1)。在同处理的3个重复小区内各随机选取两个点，用土钻分0～10 cm、10～20 cm和20～40 cm三个深度取样，将采集到的6个新鲜土样依据相同土层的土壤组成一个混合土样，并及时拣出混合土壤中可见的植物残体、根系及土壤动物(如蚯蚓等)，装于自封袋中避光保存带回实验室用于土壤酶活性的测量。土壤温度与体积含水量数据用EM-50数据收集系统监测，每间隔10 min自动记录一次数据(0～10 cm和10～20 cm土层)。地上生物量用边长50 cm的正方形木框量取后，用剪刀从地面处剪下木框内所有地上生物，全部装于自封袋中带回实验室。地下生物量依据土样的取土方法使用根钻继续取样，将采集到的根样分土层带回实验室后用清水洗净，并拣出石块和其他杂物，在65℃恒温箱烘至恒重。以上生物量最后都换算成单位面积地上干物质量(g·m-2)。

1.4 样品室内分析

1.5 数据处理分析

2 结果与分析

2.1 增温对土壤温湿度的影响

与CK相比，增温小区土壤体积含水量在0～10 cm 和10～20 cm土层分别增加了36.7%～49.4%和2.4%～4.5%，均表现为八月份土壤体积含水量最小，十月份最大(图1A，图1B)。与CK相比，增温处理小区的温度在0～10 cm和10～20 cm土层分别增加了0.9～1.3℃和0.5～0.7℃(图1C，图1D)。整体来看，增温增加了土壤温湿度，土壤湿度呈现出10～20 cm土层大于0～10 cm土层的现象。

图1 土壤温湿度变化Fig.1 Changes of soil temperature and humidity

2.2 增温施氮对土壤生物量的影响

如图2A所示，与对照(CK)相比，增温(T)处理下的生物量在0～40 cm土层显著增加了52.0%，在0～10 cm土层显著增加了22.4%，在10～20 cm土层显著增加了188.2%，在20～40 cm土层显著增加了114.4%(P<0.05)；施氮(N)处理下的生物量仅在10～20 cm土层显著增加了75.3%(P<0.05)；增温+施氮(TN)处理下的生物量在0～40 cm土层显著减少了48.0%，在0～10 cm土层显著减小了46.0%，在10～20 cm土层显著减小了35.5%，在20～40 cm土层显著减小了63.3%(P<0.05)。如图2B所示：与CK相比，T，N和TN处理均增加了地上生物量，分别显著增加了33.3%，13.8%和28.5%(P<0.05)。

图2 地上、下生物量变化Fig.2 Changes of aboveground and underground biomass注：CK，空白对照；T，增温；N，施氮；TN，增温+施氮；不同处理间显著差异用大写字母表示(P<0.05)，不同土层间显著差异用小写字母表示(P<0.05)，下同Note:CK,blank control;T,warming;N,nitrogen application;TN,warming + nitrogen application;The significant differences among different treatments are indicated by capital letters at the 0.05 level,and the significant differences among different soil layers are indicated by lowercase letters at the 0.05 level,the same as below

2.3 增温施氮对土壤理化性质的影响

2.3.1增温施氮对土壤pH值的影响 如表1所示，T处理显著降低了土壤的pH值，降低的幅度随土层加深而增大，依次是0.37，0.50和0.55(P<0.05)。N与CK处理下各土层深度的pH值相比并无显著差异。TN处理显著降低了0～20 cm土层深度的土壤pH值(P<0.05)，降低幅度为0.44和0.57。随着土层的加深，CK处理下的土壤pH值逐渐增大，而T处理则是逐渐减小，N和TN处理均呈先减后增趋势。

表1 增温和施氮对土壤pH值的影响Table 1 Effects of warming and nitrogen application on soil pH value

2.3.2增温施氮对土壤铵态氮和硝态氮的影响 如表2所示，T，N和TN处理下表层(0～10 cm)土壤铵态氮与其余两层(10～20 cm和20～40 cm)存在显著差异(P<0.05)。与CK相比，T和TN处理均显著提高了土壤铵态氮含量，TN处理增加幅度最大(P<0.05)；与CK相比，N处理则降低了土壤铵态氮含量，但无显著差异。T，N和TN处理均一定程度增加了土壤硝态氮含量，其中T和TN处理增幅显著(P<0.05)。

表2 增温和施氮对土壤铵、硝态氮的影响Table 2 Effects of warming and nitrogen application on soil ammonium and nitrate nitrogen

2.4 增温施氮对土壤酶活性的影响

2.4.1氧化还原酶 土壤硝酸还原酶活性随土层加深而逐渐减小，土壤亚硝酸还原酶活性随土层加深而逐渐增大(图3)。增温施氮对0～40 cm土层平均土壤硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性影响显著(P<0.05)。与CK相比，在0～10 cm土层，N和TN处理下的土壤硝酸还原酶活性分别显著减小了46.8%和25.6%(P<0.05)，T处理下的土壤亚硝酸还原酶活性显著减小了59.6%(P<0.05)，其他处理间的土壤硝酸还原酶和亚硝酸还原酶差异均不显著；在10～20 cm土层，T处理下的硝酸还原酶活性显著增加了70.4%，N处理下却显著减小了47.5%(P<0.05)；在20～40 cm土层，N和TN处理下的硝酸还原酶活性均分别显著减小了47.5%和43.4%(P<0.05)。此外，各处理对10～20 cm和20～40 cm土层的硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性均无显著影响。因此，T提高了土壤硝酸还原酶活性，而N和TN却降低了土壤硝酸还原酶活性，同时T，N和TN均降低了土壤亚硝酸还原酶活性。

图3 土壤氧化还原酶活性变化特征Fig.3 Variation characteristics of soil oxidoreductase activity

2.4.2水解酶 土壤脲酶、蔗糖酶和磷酸酶三种水解酶活性均随土层加深而逐渐减小(图4)。增温施氮对0～40 cm土层平均土壤脲酶、蔗糖酶和磷酸酶活性影响均不显著，但在不同土层存在一定差异。在0～10 cm土层，与CK相比，N和T处理下土壤脲酶活性分别显著增加了16.9%和10.1%(P<0.05)，TN处理下仅蔗糖酶活性显著增加了3.4%(P<0.05)，而T处理下的土壤磷酸酶活性却显著降低了22.5%(P<0.05)，其他各处理的三种水解酶均与CK差异不显著。在10～20 cm和20～40 cm土层，三种水解酶均无显著差异，但与CK相比均有一定程度增减。土壤脲酶活性在T，N和TN处理下均有一定程度增加，N处理减小了蔗糖酶活性，磷酸酶活性在N和TN处理下有所增加。

图4 土壤水解酶活性变化特征Fig.4 Characteristics of soil hydrolase activity change

酶活性的几何平均值(GEM)结果显示，与CK相比，0～40 cm土层的平均土壤酶活性在N处理下存在显著差异(P<0.05)。在0～10 cm土层，与对照相比，T和N处理下的GEM分别显著减少了17.7%和12.1%(P<0.05)；在10～20 cm和20～40 cm土层，N处理下的GEM分别显著减少了12.0%和14.9%(P<0.05)。与CK相比，T处理在10～20 cm土层提高了GEM，N处理在0～40 cm各土层间均降低了GEM，而TN处理在0～40 cm各土层间均提高了GEM(图4D)。

三因素方差分析表明，增温施氮对土壤酶活性影响显著(表3)；增温对蔗糖酶(Sucrase，SUC)，硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)和亚硝酸还原酶(Nitrite reductase，NIR)有极显著影响(P<0.01)；施氮对磷酸酶(Phosphatase，PHO)和NR有极显著影响(P<0.01)；增温和施氮的交互作用对脲酶(Urease，URE)、SUC和PHO存在极显著影响(P<0.01)；土层变化对URE，SUC，NR和NIR有极显著影响(P<0.01)；增温、施氮和土层三者的交互作用对URE和PHO有极显著影响(P<0.01)。

表3 增温、施氮与土层交互作用下土壤酶活性的三因素方差分析Table 3 Variance analysis of soil enzyme activities under the interaction of warming,nitrogen application and soil layer

2.5 土壤酶活性与土壤因子相关性分析

表4 土壤因子和土壤酶活性之间的相关系数Table 4 Correlation coefficient between soil pH,ammonium nitrogen,nitrate nitrogen and soil enzyme activity

3 讨论

3.1 土壤温湿度对增温的响应

土壤酶活性受水热条件影响明显，本研究发现，增温明显提升了土壤表层地温，增温幅度介于0.5～1.3℃之间。增温亦明显增加了土壤表层的含水量，随土层加深土壤含水量有持续增加的现象。这与刘光生等[25]研究结果相符合。对于高寒草甸而言，主要原因可能是温度升高使得浅层的冻融土壤融化，使得水分下渗，昼夜巨大温差使得深层土壤易发生冻结现象，冻融锋面阻隔了水分的进一步下渗，使得水分在土壤表层间聚集。增温增高了气室内的地上生物量高度，使得水分不易挥发，故表层土壤含水量也有所增加[26]。增温现象所引起光热条件的改变导致了土壤温湿度及生物量发生变化，也将会对土壤酶活性产生影响，由此可见，增温是土壤酶活性的影响因素之一。

3.2 土壤酶活性对短期增温和施氮的响应

气候变暖和氮沉降对土壤酶活性有着不可忽视的影响。本研究发现，增温提高了土壤脲酶、蔗糖酶和硝酸还原酶活性，却降低了磷酸酶和亚硝酸还原酶活性。高艳娜[10]和杨文英[11]等对湿地的研究发现，增温一定程度上提高了土壤脲酶、蔗糖酶和磷酸酶活性；土壤脲酶和蔗糖酶对增温的响应与本文结果一致，增温对磷酸酶的影响与本文研究相悖，原因可能是短期的增温效果对磷酸酶并未起到关键作用，杨玉莲等[27]对高山森林土壤微生物和酶活性的研究表明增温抑制土壤磷酸酶活性，与本文研究相符。李龙等[28]研究冻融过程对长白山不同林型土壤酶活性的影响所得结果显示增温可以提高硝酸还原酶活性，降低亚硝酸还原酶活性，这与本文所得结论一致。土壤酶主要来源于植物根系活动、土壤动物活动及动植物残体，土壤温度的提高在促进动植物释放分泌的同时，也会增加土壤中酶的反应底物使得酶活性增强[7]。适宜的温度对土壤酶活性存在直接作用，温度引起的土壤水分和动植物及微生物变化对土壤酶存在间接影响。增温过程提高了地上及地下生物量(图2)，促进了植物根茎及腐朽枝叶的进一步分解，加速了死亡土壤动物的分解过程，在丰富土壤养分的同时也起到了提高土壤水解酶活性的作用[29-31]。而对于氧化还原酶，增温导致含水量增加后会抑制好氧微生物的活动，从而抑制了土壤酶活性[32]。

本研究发现，施氮提高了土壤脲酶和蔗糖酶活性，这与潘超峰等[33]、尹松鹏等[21]和宋学贵等[34]研究结果相符。施氮增加了脲酶反应的底物和土壤中有效氮的含量，为满足营养需求微生物需要分泌更多的脲酶来分解，从而导致脲酶活性的增大。施氮促进了蔗糖酶水解蔗糖生成葡萄糖和果糖这一过程的运行，提高了土壤养分浓度。施氮提高了土壤磷酸酶活性，这与张欣等[35]研究结果相似，磷酸酶主要是水解磷酸形成正磷酸盐，提高磷元素的有效性[36]，提高了土壤养分。马琳娜等[37]研究发现，施氮显著降低了全磷和速效磷的含量，这与本文研究结果不同，原因可能是磷酸酶与其他土壤酶活性之间存在相互作用，有待进一步研究。其次，本研究发现，施氮降低了土壤硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性，硝酸还原酶可以酶促土壤中的硝态氮还原成氨，亚硝酸还原酶可以酶促土壤中的亚硝酸盐转化为氢氧化铵。在施氮后，氮素会增强土壤中的硝化作用，硝态氮增加，土壤中硝态氮含量的增加使得硝酸还原酶的酶促作用减弱，进一步限制了亚硝酸还原酶的酶促作用[7]。这与张欣等[35]、白春华等[38]研究发现增温、施氮和增温施氮均一定程度的增加了土壤中硝态氮的含量结果相一致。

增温和施氮对土壤酶活性的影响并不孤立，而是相互促进与制约。增温和施氮的交互作用对土壤酶活性的影响受土壤养分和土壤水热条件等众多环境因素的影响[39]。本文研究表明，增温与施氮的交互作用在土壤表层提高了土壤脲酶、蔗糖酶和磷酸酶活性。脲酶对增温和施氮处理均表现为促进作用，增温和施氮两者的交互作用也起到了提高脲酶活性的作用，说明增温和施氮对脲酶是相互促进的；增温处理降低了蔗糖酶和磷酸酶活性，而施氮和增温施氮处理提高了其酶活性，说明蔗糖酶和磷酸酶对施氮的响应更为明显。增温施氮处理降低了硝酸还原酶和亚硝酸还原酶活性，这可能是因为常年的高寒环境使得硝酸和亚硝酸还原酶活性已经适应了高寒的胁迫作用[21]，土壤中的氮素含量已经满足其反应底物的浓度，氮素的施加使得反应底物超出了酶促作用的上限，反而导致了酶活性的下降。

4 结论

通过对尕海湿地沼泽化草甸生长盛期土壤酶活性的分析，研究了短期增温和氮添加对土壤酶活性的影响，结果发现短期的增温施氮引起了水热条件和土壤中氮含量发生变化，使土壤中植物根系和有效氮含量得以增加，在分解作用下加速了氮循环和养分循环，是导致土壤酶活性发生变化的主要因素，未来气候变暖和氮沉降加剧将会增加土壤水解酶活性，而降低了氧化还原酶活性，对土壤酶活性的研究可以更深入的了解未来气候变暖和氮沉降背景下湿地的土壤养分循环过程。