京尼平巩膜交联对形觉剥夺性近视模型兔安全性的研究

许寅聪，陈 达，陈 静，刘超敏，李 娟，王超英，张素华，赵亚芳

目前，全球近视人口数量不断增长，近视发病率过快增长已引起社会高度关注。据统计，全世界高度近视患者约有1.63亿[1-2]。61.7%的高度近视人群会出现严重并发症，特别是当近视度数超过-10.00 D时，极易出现黄斑病变[3-4]，引起患者生活质量严重降低，带来沉重的社会负担，且临床上缺乏控制近视的有效手段。受到紫外线A-核黄素角膜交联技术在角膜疾病中应用的启发[5-6]，国内外学者积极探索巩膜胶原交联方法并希望将其应用于病理性近视的治疗中，目前巩膜的交联方法分为物理交联和化学交联两种[7]。本实验为探索化学交联方法，采用后Tenon's囊下注射京尼平的方法，将药物直接注射于后极部巩膜，希望引起后极部巩膜的交联效应，增强巩膜生物力学强度，达到延缓或抑制近视发展的目的。京尼平是一种天然交联剂，提取自中药栀子，是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，具有良好的生物相容性和低毒性，因此得到国内外学者的青睐[8-9]。近年国内外部分学者围绕京尼平的交联效应展开了一系列研究，证明了京尼平确实可以增强巩膜的生物力学强度，但是对其安全性仍不甚明确[10-12]。故本研究通过观察形觉剥夺性近视模型兔进行京尼平巩膜交联后视网膜的电生理以及视网膜、巩膜纤维、视神经纤维、眼外肌纤维的形态变化，来评估京尼平巩膜交联的安全性。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂 选择14日龄健康幼兔(新西兰大白兔)60只(购自河北医科大学实验动物中心)，雌雄不限，在解放军联勤保障部队第九八〇医院实验动物中心由专人进行饲养。研究涉及实验动物已经取得医院动物实验伦理委员会批准(批准编号2018-KY-09)。京尼平产地日本。新生牛血清和二甲基亚砜(DMSO)均购自北京索莱宝生物科技有限公司。RetiMINER-S型视觉电生理仪购自重庆艾尔曦医疗设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1实验动物分组及模型建立：60只幼兔饲养室温20～23 ℃，光照与黑暗的周期比例为1∶1。采用随机数字表法将60只幼兔分为空白对照组、近视模型组和京尼平注射+眼睑缝合组3组，每组20只，均以右眼为实验眼，左眼未处理。空白对照组双眼均不处理，近视模型组实验眼进行眼睑缝合，京尼平注射+眼睑缝合组实验眼结膜下注射0.5 mmol/L京尼平0.25 ml，隔日1次，连续注射4次，每次注射后缝合眼睑，注射前拆线进行下一次注射，第一次和第三次注射部位为鼻上1点钟方向角膜缘后3 mm Tenon's囊下，第二次和第四次注射部位为颞下7点钟方向角膜缘后3 mm Tenon's囊下。眼睑缝合均采用双“U”字形缝合，使用氧氟沙星眼膏涂眼每日1次，眼睑缝合共持续60 d。

1.2.2闪光视网膜电图(F-ERG)检查：实验60 d后使用复方托吡卡胺滴眼液充分双眼散瞳，将幼兔置于绝对暗室进行暗适应20 min，后固定幼兔，使用氯胺酮注射液35 mg/kg肌内注射麻醉，使用0.5%丁卡因进行角膜表面麻醉，使用表面涂有氧氟沙星眼膏的角膜电极置于角膜表面(作用电极为镀金角膜电极，记录条件符合国际标准)，参考电极和接地极分别安置在幼兔额部正中和耳缘皮下，摆放幼兔头位置伸入刺激球，使检测眼正对刺激球闪光点。行双眼F-ERG检查，顺序为实验眼暗适应3.0检查(无背景光，3.0 cd×s/m2，白色闪光，通频带1～300 Hz)，对照眼行暗适应3.0检查。检查期间对侧眼始终用遮光眼罩完全遮盖，所有测量均由同一名技术人员完成。

1.2.3病理形态学检查：实验60 d后，使用氯胺酮注射液(35 mg/kg)肌内注射麻醉，选择空气栓塞法处死幼兔，固定于手术台上，在无菌条件下取出眼球，清除结膜及筋膜，保留眼外肌和视神经，将眼球标记清楚，依次放入眼球保存液1(25%新生牛血清，2% DMSO，2.5%蔗糖)、液2(25%新生牛血清，4% DMSO，5.5%蔗糖)、液3(25%新生牛血清，6% DMSO，7.5%蔗糖)，在每种保存液中浸泡10 min，最后置于眼球保存液4(25%新生牛血清，7.5% DMSO，10.0%蔗糖)中，密封好后放入-196 ℃液氮中保存。运输至光镜实验室，将离体兔眼从液氮中取出后放入37 ℃水浴箱中复温，然后使用10%甲醛固定24 h，石蜡包埋，于视神经颞侧垂直巩膜连续切片至外直肌，视神经使用垂直视神经轴位方向切片，厚度0.5 μm，进行HE染色，用光学显微镜逐层观察视网膜、视神经、巩膜、眼外肌，并照相记录。

1.3观察指标 对3组均进行F-ERG检测，比较a波振幅、a波潜伏期、b波振幅、b波潜伏期。因考虑需评估京尼平的不良反应，仅对京尼平注射+眼睑缝合组进行光学显微镜HE染色观察眼部结构，包括巩膜、眼外肌、视网膜、视神经结构，以及观察视网膜细胞、巩膜胶原纤维、视神经纤维、眼外肌纤维排列情况和是否存在炎性细胞浸润。

2 结果

2.1F-ERG检查结果 在实验60 d后对3组幼兔进行F-ERG检查，分析暗适应3.0检查结果发现，3组的a波振幅、b波振幅、b波潜伏期比较差异有统计学意义(P<0.05)。但3组间a波潜伏期比较差异无统计学意义(P>0.05)。近视模型组a波振幅、b波振幅、b波潜伏期与空白对照组和京尼平注射+眼睑缝合组比较均显著降低(P<0.05)，但空白对照组与京尼平注射+眼睑缝合组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组幼兔实验眼闪光视网膜电图检查结果比较

2.2病理组织学观察 对京尼平注射+眼睑缝合组进行观察，角膜、结膜及巩膜大体观察实验眼与对照眼之间无明显差别。见图1。HE染色后，使用光学显微镜观察实验眼发现巩膜、眼外肌、视网膜、视神经结构清晰，未发现异常变性坏死视网膜细胞，巩膜胶原纤维、视神经纤维、眼外肌纤维均排列整齐，所有组织均未见明显炎性细胞浸润。见图2。

图1 京尼平注射+眼睑缝合处理幼兔角膜、结膜及巩膜大体观察

图2 京尼平注射+眼睑缝合处理幼兔实验眼视网膜、巩膜纤维、神经纤维、眼外肌纤维病理组织学观察(HE×200)

3 讨论

病理性近视的发病机制与巩膜的生物力学特点和自身的缺点有关，因为从眼球壁三层结构的力学性能来看，在相同应力的作用下，从视网膜、脉络膜到巩膜的切线模量呈逐步递增的趋势[13]，而巩膜胶原纤维在后巩膜葡萄肿形成过程中起到了至关重要的作用。目前临床治疗病理性近视方法匮乏，国内临床应用相对广泛的是后巩膜加固术，手术对于高度近视黄斑裂孔、阻止眼球继续增长具有一定效果[14]，但其长期有效性及安全性仍需观察。目前，探索巩膜胶原交联方法并用于病理性近视的治疗成为研究热点，其中天然交联剂京尼平因具有优良生物相容性和低毒性在众多交联剂中脱颖而出，本文围绕京尼平巩膜交联的安全性进行研究。

本研究设计了3组，分别为空白对照组、近视模型组、京尼平注射+眼睑缝合组，这样分组的目的是为更全面观察形觉剥夺性近视模型兔中京尼平巩膜交联的安全性。在视网膜电生理检查指标中选择F-ERG暗适应3.0检查，这是因为目前临床应用的各项检查中只有暗适应3.0检查可综合反映视杆细胞和视锥细胞混合系统功能，其主要观察指标是a、b波的潜伏期和振幅，a波反映视杆细胞和视锥细胞的功能，b波反映双极细胞的功能。之所以选择幼兔作为动物模型是因为出生14～74 d处于眼球的快速发育阶段[15]，此阶段有利于形觉剥夺性近视模型建立，同时也模拟了病理性近视眼轴延长的过程。

本文F-ERG暗适应3.0检查结果显示，近视模型组实验眼的a波振幅、b波振幅较空白对照组出现了显著的降低，说明在形觉剥夺60 d后幼兔发生了近视化，与此同时视网膜细胞功能出现下降。本研究还显示，京尼平注射+眼睑缝合组的a波振幅及潜伏期、b波振幅及潜伏期均无异常，这除了说明京尼平巩膜交联有良好安全性外，还证明其可通过控制巩膜扩张起到保护剥夺性近视致视网膜功能损伤作用。

考虑到在实际注射京尼平后，药物存在局部扩散使得京尼平巩膜交联不具备特异性，巩膜周围的眼外肌、视神经、血管等组织均存在被交联的可能性，所以本研究又观察了京尼平注射+眼睑缝合组实验眼的病理学形态改变，使用光学显微镜HE染色观察发现，巩膜、眼外肌、视网膜、视神经结构清晰，未发现异常变性坏死视网膜细胞，巩膜胶原纤维、视神经纤维、眼外肌纤维均排列整齐，所有组织均未见明显炎性细胞浸润，这说明京尼平对于视网膜、巩膜、视神经、眼外肌是安全的。但本研究仅选择使用光学显微镜进行检查，未能使用高倍电镜观察细胞内的微结构改变，今后需进行补充以使结果更具有说服力。

前期研究发现，对形觉剥夺性近视模型兔进行京尼平巩膜交联后的巩膜条带弹性模量、极限应力均出现显著增强，极限应变、蠕变率出现降低，说明交联后巩膜不易发生变形扩张[16]。HOANG等[17]也通过热力学实验发现，京尼平交联活体兔眼巩膜后会提高其收缩温度，阐明了后Tenon's囊下注射京尼平可以提高巩膜的生物力学强度，有效阻止近视的发生发展。

总之，对形觉剥夺性近视模型兔眼后Tenon's囊下注射京尼平进行巩膜胶原交联能提高巩膜生物力学强度，有效阻止动物模型近视眼发展；有良好安全性，不会损伤视网膜视细胞功能，对巩膜、视网膜、视神经及眼外肌细胞不会构成形态学损伤。