人乳牙牙髓干细胞膜片在组织工程牙髓再生中的实验研究

谢 娜，陆 磊，姬小婷，王丹杨，唐成芳，李子夏，胡 妍，李 旋

（1.西安医学院口腔医学院 陕西 西安 710021；2.陕西中医药大学附属医院口腔科 陕西 咸阳 712000）

牙髓再生是目前牙齿组织再生中最具挑战性的课题之一，这是由于牙髓组织稳定的内部结构和自身有限的修复能力所致。随着现代组织工程技术的发展和各种干细胞的发现将为年轻恒牙牙髓坏死的治疗开辟新的研究领域[1]。本实验中利用人乳牙牙髓干细胞（Stem cells derived from exfoliated deciduous teeth，SHED）、生物支架材料聚乙丙交酯（PLGA）、人乳牙牙髓干细胞膜片以及处理过的牙本质基质片段在裸鼠体内进行牙髓再生的实验研究，以期构建出一种适合临床应用的牙髓再生策略，为年轻恒牙发生牙髓坏死的生物学治疗提供新的参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物：BALB/c裸鼠（上海斯莱克实验动物有限公司购买，西安交通大学医学院动物房饲养）。

1.2 试剂和器材

1.2.1 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清（Hyclone，北京）；Ⅰ型胶原酶、Dispase酶（Gibco，美国）；DSPP单克隆抗体（Santa，美国）；PLGA（济南岱罡生物科技有限公司，山东）。

1.2.2 主要仪器：细胞培养箱（Thermo，美国）；酶联检测仪（Amersham Biosciences，瑞典）；Motic Med 6.0数码医学图像分析系统（厦门麦克奥迪有限责任公司，福建）。

1.3 实验方法

1.3.1 人乳牙牙髓细胞的获取、培养和纯化：选取临床中需要拔除的6～8岁儿童滞留的乳前牙（经伦理审批会审批，拔除前患者签署知情同意书），在超净台内用PBS液冲洗后拔除牙髓组织，浸泡于1:1混合的Ⅰ型胶原酶和Dispase酶中。将牙髓组织剪成0.5～1 mm3大小的组织块，5% CO2、37℃的细胞培养箱中孵育45～60 min。待组织块完全消化、溶解后转移至离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用含15%胎牛血清的DMEM/F12（培养基中加入100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素和2 mM的L-谷氨酰胺）培养基重悬细胞，随后移至60 mm培养皿中培养。有限稀释法对所培养的细胞进行克隆纯化。

1.3.2 牙本质基质片段的制备

1.3.2.1 实验材料获取：实验所需的牙本质片段来源于临床上5～12岁患者所拔除的多生牙（经伦理审批会审批，拔除前患者签署知情同意书）。

1.3.2.2 制备实验所需的牙本质基质片段：去除牙齿表面的牙周组织，以根尖处为起点，截取长度约为6～7 mm的牙根，拔除根管内的牙髓组织，均匀磨除根管内壁的部分前期牙本质，扩大根管直径为1～2.5 mm。根管一端用MTA封闭1 mm，另外一端不做任何处理。将所制备的牙本质片段分别放入17% EDTA、19%柠檬酸、碘伏和5.25%次氯酸钠溶液中处理，用PBS漂洗数次后，置于无菌PBS液中，37℃的条件下浸泡3～7 d。4℃储存于DMEM/F12的培养基中备用[2]。

1.3.3 人乳牙牙髓干细胞膜片的培养：取第3代SHED，调整细胞浓度为1×105个/毫升，用含10% FBS、100 μmol/L的L-抗坏血酸-2-磷酸盐、2 mmol/ml的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基连续培养14 d。动物实验前弃去培养皿中的培养基，用探针和眼科镊沿着培养皿的边缘将所培养的细胞膜片缓慢的从培养皿底部剥离，将剥离后的SHED细胞膜片小心折叠为长约4～5 mm，直径约为1～2 mm的圆柱体，再置于所制备的牙本质基质片段的根管内，将负载细胞膜片的牙本质基质片段迅速的置入培养皿中，加入培养基后在37℃、5% CO2细胞孵育箱内继续孵育3 h，用于后续的动物实验。

1.3.4 细胞-支架材料复合物的制备：取生长状态良好的第三代SHED，待其融合至培养皿底的80%～90%时，更换为矿化诱导液，体外连续诱导7 d后胰蛋白酶消化3～5 min，1 000 r/min离心5 min，用不含胎牛血清的矿化诱导液吹打细胞沉淀，制备成单细胞悬液，调整细胞密度为1×107个/毫升，按此密度将50 μl的细胞悬液接种至已灭菌消毒过的大小为1.5～2.0 mm3的支架材料PLGA上，将细胞-材料复合物置入预先制备的牙本质基质片段中，再将其转移至37℃、5% CO2培养箱内继续孵育3 h，用于后续的动物实验。

1.3.5 实验分组：分为5组，空白对照组（单纯牙本质基质片段组）、阴性对照组（负载支架材料的牙本质基质片段组）、SHED-PLGA组（负载细胞-支架材料复合物的牙本质基质片段组）、SHED细胞膜片组（负载细胞膜片的牙本质基质片段组）和阳性对照组（临床上拔除的多生牙，其未作任何处理）。

1.3.6 裸鼠体内异位移植实验：取4周龄雄性裸鼠6只，腹腔麻醉后，在其背部皮肤处剪开约10 mm的切口，制备皮下袋，左右两侧相对应的部位分别随机植入不同的实验组。裸鼠皮下异位移植12周后，取出裸鼠背部皮下组织中植入的复合物，固定、脱钙、包埋、切片，进行HE染色和DSPP免疫组织化学法染色。

1.3.7 灰度扫描：利用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对免疫组化染色结果进行灰度扫描，将所得数据与阴性对照组的灰度值相比后，对所得数据利用SPSS 13.0统计学软件进行分析。

2 结果

2.1 人乳牙牙髓细胞的培养：采用酶解组织块法对人乳牙牙髓细胞进行原代培养，一般培养24 h后就可观察到细胞的伪足已经开始逐渐伸展（见图1A），3～5 d后伪足基本上已经全部伸展开。大多数完全伸展开的人乳牙牙髓细胞呈长梭状，类似于成纤维细胞的形状，少数人乳牙牙髓细胞为多角形、椭圆形或者呈现出纺锤形（见图1B）。

图1 倒置相差显微镜下观察人乳牙牙髓细胞（100×）

2.2 SHED细胞膜片的培养：生长状态良好的第3代SHED用含维生素C的DMEM/F12培养基连续培养7～10 d后，在培养皿的底部，肉眼可见一层成绒状的白色薄膜，薄膜与培养皿底部紧密贴附，在培养皿边缘处的薄膜有轻微的卷曲，晃动或倒置后薄膜均不会发生脱落，此层薄膜即为细胞膜片。倒置显微镜下观察可见细胞彼此间连接紧密呈长梭形，并呈重叠的复层（见图2A），细胞继续培养至14 d时，用探针和眼科镊沿着培养皿的边缘将所培养的细胞膜片缓慢的从培养皿底部剥离，所得的膜片出现皱缩，呈现为乳白色的膜状物，具有一定的厚度和强度（见图2B）。

图2 培养的SHED细胞膜片

2.3 裸鼠体内的异位移植

2.3.1 取4周龄的雄性裸鼠6只，用4%的水合氯醛腹腔麻醉后，分别将体外所构建的牙本质基质片段移植入裸鼠的背部所制备的皮下袋中，严密缝合（见图3）。

图3 裸鼠皮下移植实验

2.3.2 HE染色：空白对照组的根管内未见牙髓样组织生成，仅有裸鼠背部的修复性组织长入，长入的组织中含有完整的血管样结构（见图4A～B）；阴性对照组的根管内也未见有牙髓样组织生成，除了长入的裸鼠背部的修复性组织之外，还在根管内见到一些未完全降解的支架材料（见图4C～D）；SHED-PLGA组在根管内可见疏松的牙髓样组织生成，其间有血管穿行，还可见到少量的尚未完全降解的支架材料，原有牙本质根管壁最内侧有一层不连续的成牙本质细胞样细胞生成，细胞呈单层排列，并且有少量粉染的牙本质基质形成，甚至还可见一些成牙本质细胞样细胞突起伸入到新形成的牙本质基质中（见图4E～F）；SHED细胞膜片组在根管内也可见一些牙髓样组织生成，其组织密度介于阳性对照组和SHED-PLGA组之间，血管穿行于其中，在根管壁的最内侧也可见到不连续的单层成牙本质细胞样细胞生成，在新生成细胞的牙本质侧形成了牙本质基质，有成牙本质细胞样细胞的突起伸入到新形成的牙本质基质中（见图4G～H）；阳性对照组可见大片呈红染的牙本质，根管内的牙髓组织较致密，其中包含完整的血管，在牙本质最内层有一层浅染的尚未矿化的前期牙本质层，紧贴着前期牙本质层有复层排列的柱形成牙本质细胞，其细胞顶端有细长的突起深入到牙本质基质内（见图4I～J）。

图4 HE染色结果

2.3.3 牙本质涎磷蛋白免疫组化染色：对各组样本进行牙本质涎磷蛋白免疫组化染色，可见阳性对照组前期牙本质对牙本质涎磷蛋白呈阳性表达，组织染色后为棕黄色；成牙本质细胞对牙本质涎磷蛋白也同样呈阳性表达：细胞的胞浆为棕黄色着色，胞核复染后为蓝色；SHED-PLGA组和SHED细胞膜片组均可见新生的成牙本质细胞样细胞和牙本质基质对牙本质涎磷蛋白呈阳性表达，这与阳性对照组的染色结果一致；空白对照组和阴性对照组可见根管内新生成的组织对牙本质涎磷蛋白呈阴性表达：细胞的胞浆未见明显着色，胞核复染后为蓝色（见图5）。

图5 DSPP免疫组织化学法染色结果

2.3.4 灰度扫描结果分析：利用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对DSPP免疫组化染色结果进行灰度扫描，将SHED细胞膜片组、SHED-PLGA组和阳性对照组的灰度值与阴性对照组的灰度值进行比较后，对所得的结果利用SPSS 13.0统计学软件采用单因素方差分析后可知SHED细胞膜片组的组织生成量明显的多于SHED-PLGA组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

图6 DSPP免疫组化灰度扫描分析

3 讨论

利用组织工程技术进行牙髓再生的实验研究中，寻找合适的种子细胞是首先要解决的问题之一。牙源性干细胞与其他组织来源的干细胞一样，都具有自我更新和多向分化的特性，因此可作为种子细胞应用于牙髓再生的实验研究中。儿童脱落的乳牙属于废弃的组织，因而较少涉及伦理以及道德等方面的问题，且乳牙具有取材简便、对供体的损伤较少、不容易污染、便于实现后期自体移植等方面的优点，在临床应用中的前景十分广阔[3-4]。因此，本实验选用人乳牙牙髓细胞作为种子细胞，探讨其在牙髓再生应用中的可行性。

牙本质基质片段作为一种纯天然的多孔支架材料，本身含有多种有机成分，如胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor，IGF）、转化生长因子（Transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形态发生蛋白（Bone morphogenic proteins，BMP）等，这些生长因子作为牙本质和牙髓组织修复过程中的重要信号分子，在组织的生理再生过程中发挥着非常重要的作用，因此它与其它化学合成的支架材料相比具有一定的优越性，被广泛的应用于组织工程牙髓再生的实验研究之中[5-6]。

然而无论使用任何支架材料作为种子细胞的载体，细胞和支架材料负载的过程中都存在着以下的问题[7-8]：①细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）存在的多种细胞生长因子以及蛋白会因为胰蛋白酶消化获取种子细胞的过程中大量破坏，进而会严重影响细胞的生物学行为；②细胞与支架材料复合的过程中，接种在支架材料上的细胞密度有限，也会影响组织的再生能力；③可降解的支架材料在降解的过程中会遗留有一定的空隙，进而会影响组织再生的范围；④支架材料在体内有可能会和机体发生炎症反应。

由于这些问题的存在，具有一定三维立体结构的细胞膜片技术被广泛的应用于组织工程的研究之中。细胞膜片最早由Okano等[9]发现以来，因其能最大限度的保护细胞膜表面的相关蛋白、细胞间相互连接以及细胞-细胞外基质连接等结构，因此受到广大学者们的关注。细胞膜片是采用高密度浓度接种细胞、成膜诱导液以及结合相关物理化学手段，从而构建一种富含细胞外基质并且具备一定可操作性以及兼备机械强度的细胞膜片结构[10-11]。本实验中采用Yang等[2]的培养方法，在培养基中加入了适量的维生素C和L-谷氨酰胺，成功诱导形成了SHED细胞膜片。

裸鼠背部皮下组织中异位移植12周后，经HE染色以及DSPP免疫组化实验发现：SHED细胞膜片组和SHED-PLGA组均在多生牙的根管内生成了包含完整血管的牙髓样组织，并且在原有的牙本质壁上还形成了一层不连续的钙化牙本质基质，紧贴着新生成钙化组织的内侧有一层成牙本质细胞样细胞生成。DSPP免疫组化的灰度扫描分析提示：SHED细胞膜片组与SHED-PLGA组相比，可以新生出更多成牙本质细胞样细胞并且分泌出更多的牙本质基质。

究其原因，这可能与细胞膜片本身所具备的特点有关[12]：①细胞膜片是由种子细胞自身产生的ECM所形成的膜片状物质，种子细胞在体外通过条件诱导液诱导后可以在短时间内促使细胞分泌大量的细胞外基质，从而将细胞与细胞之间紧密连接之后形成一种三维立体的膜片状结构，不需要经过胰蛋白酶消化后获取种子细胞，因此对种子细胞损伤较小；②细胞膜片可维持细胞之间正常的连接，并可最大限度地保持细胞外基质的完整性，膜片本身富含大量的细胞外基质可诱导SHED分化为牙本质细胞样细胞，从而分泌大量的牙本质基质，并进一步矿化为牙本质样组织，因此细胞膜片对于组织工程牙髓再生起到了极其重要作用[13-15]。

但是，SHED细胞膜片组新生成的组织并没有达到整个根管充满，推测这主要与细胞膜片在折叠后没有具备一定的孔隙结构，因而会对新生成组织的血供产生一定的影响，进而限制了组织的进一步生成。在后续的实验中考虑是否可以将所培养的细胞膜片包裹于支架材料上，这样既解决了种子细胞获取过程中的损伤问题，又为细胞的生长提供了一定的空隙，从而为新形成的组织提供必要的条件。

人乳牙牙髓干细胞是牙科再生医学研究领域中极具潜力的牙源性的成体干细胞之一，因此对其的研究具有十分广泛的意义。目前，对于发生牙髓疾病的生物学治疗的最终目标是要生成具有活力的牙髓组织。因此，随着组织工程学的不断发展，在高效的诱导分子调控机制作用下，在不久的将来，希望可以利用人乳牙牙髓干细胞和适合的生物支架材料再生出具有活力的牙髓组织，并将其广泛的应用于临床治疗年轻恒牙发生牙髓坏死的患者之中，为广大患者带来福音。